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      • RNAseq数据,下载GEO中的FPKM文件后该怎么下游分析

      RNAseq数据,下载GEO中的FPKM文件后该怎么下游分析

      • 发布者 weinfoeditor
      • 分类 未分类
      • 日期 2019年12月13日
      • 评论 0评论
      • 文献标题是:Oncogenic lncRNA downregulates cancer cell antigen presentation and intrinsic tumor suppression不过不需要看文章,大家只需要做差异分析即可,这个时候需要注意的是,作者提供的是RPKM值表达矩阵!
      • 6个样本,分成2组,是RPKM值表达矩阵,做差异分析,看GO通路,跟文章比较
      • 作业:(f) Enrichment of GO biological process (BP) terms for up-regulated genes (red) and down-regulated genes in tumor versus normal samples (n = 3, 3 animals). (g-i) Log2 of fold changes of indicated metabolites in MMTV-Tg(LINK-A) breast tumor compared to that of Tg(LINK-A) mammary gland (n = 3 animals respectively).
      • 首先需要去GEO数据库下载文件GSE113143_Normal_Tumor_Expression.tab.gz

      1.下载数据GSE113143并加载数据

      a=read.table('GSE113143_Normal_Tumor_Expression.tab.gz',sep='\t',quote = "",fill = T,
                   comment.char = "!",header = T) # 提取表达矩阵
      rownames(a)=a[,1]
      a <- a[,-1]
      
      • TPM值就是RPKM的百分比:关于TPM的解释可以看看这个
      • What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units
      • Question: Differential expression analysis starting from TPM data

      2.将FPKM转换为TPM

      expMatrix <- a
      fpkmToTpm <- function(fpkm)
      {
        exp(log(fpkm) - log(sum(fpkm)) + log(1e6))
      }
      tpms <- apply(expMatrix,2,fpkmToTpm)
      tpms[1:3,]
      colSums(tpms)
      #输出结果:
      > tpms[1:3,]
                        N1      N2    N3    T1    T2    T3
      0610005C13Rik  0.232  0.1715  0.00  0.00  0.00  0.00
      0610007P14Rik 48.391 39.2632 46.04 50.04 59.05 67.29
      0610009B22Rik 47.491 58.5954 54.27 49.79 53.13 58.00
      > colSums(tpms)
         N1    N2    N3    T1    T2    T3 
      1e+06 1e+06 1e+06 1e+06 1e+06 1e+06 
      

      3.差异分析

      group_list=c(rep('Normal',3),rep('Tumor',3))
      ## 强制限定顺序
      group_list <- factor(group_list,levels = c("Normal","Tumor"),ordered = F)
      #表达矩阵数据校正
      exprSet <- tpms
      boxplot(exprSet,outline=FALSE, notch=T,col=group_list, las=2)
      library(limma) 
      exprSet=normalizeBetweenArrays(exprSet)
      boxplot(exprSet,outline=FALSE, notch=T,col=group_list, las=2)
      #判断数据是否需要转换
      exprSet <- log2(exprSet+1)
      #差异分析:
      dat <- exprSet
      design=model.matrix(~factor( group_list ))
      fit=lmFit(dat,design)
      fit=eBayes(fit)
      options(digits = 4)
      topTable(fit,coef=2,adjust='BH')
      bp=function(g){
        library(ggpubr)
        df=data.frame(gene=g,stage=group_list)
        p <- ggboxplot(df, x = "stage", y = "gene",
                       color = "stage", palette = "jco",
                       add = "jitter")
        #  Add p-value
        p + stat_compare_means()
      }
      deg=topTable(fit,coef=2,adjust='BH',number = Inf)
      head(deg) 
      #save(deg,file = 'deg.Rdata')
      

      划重点:以下代码、方法全来自生信技能树的最新推文:为R包写一本书(向Y叔致敬)

      这里面重点就是:RPKM矩阵可以转为TPM后,再使用limma进行差异分析哦!

      4.做完差异分析

      • GEO数据挖掘代码,很容易得到上下调基因,而且转为ENTREZID,后续分析都以这个为主线。
      • 根据原文文献中:Differential gene expression was defined if the fold change >1.5 and P < 0.05 between tumor and normal samples找差异基因
      ## 不同的阈值,筛选到的差异基因数量就不一样,后面的超几何分布检验结果就大相径庭。
      if(T){
        logFC_t=1.5
        deg$g=ifelse(deg$P.Value>0.05,'stable',
                     ifelse( deg$logFC > logFC_t,'UP',
                             ifelse( deg$logFC < -logFC_t,'DOWN','stable') )
        )
        table(deg$g)
        head(deg)
        deg$symbol=rownames(deg)
        library(ggplot2)
        library(clusterProfiler)
        library(org.Mm.eg.db)
        df <- bitr(unique(deg$symbol), fromType = "SYMBOL",
                   toType = c( "ENTREZID"),
                   OrgDb = org.Mm.eg.db)
        head(df)
        DEG=deg
        head(DEG)
      
        DEG=merge(DEG,df,by.y='SYMBOL',by.x='symbol')
        head(DEG)
      
        save(DEG,file = 'anno_DEG.Rdata')
        gene_up= DEG[DEG$g == 'UP','ENTREZID'] 
        gene_down=DEG[DEG$g == 'DOWN','ENTREZID'] 
      }
      

      5.最简单的超几何分布检验

      # 最简单的超几何分布检验
      ###这里就拿KEGG数据库举例吧,拿自己判定好的上调基因集进行超几何分布检验,如下
      if(T){
        gene_down
        gene_up
        enrichKK <- enrichKEGG(gene         =  gene_up,
                               organism     = 'mmu',
                               #universe     = gene_all,
                               pvalueCutoff = 0.05,
                               qvalueCutoff =0.05)
        head(enrichKK)[,1:6] 
        browseKEGG(enrichKK, 'hsa04512')
        dotplot(enrichKK)
        ggsave("enrichKK.png")
        enrichKK=DOSE::setReadable(enrichKK, OrgDb='org.Mm.eg.db',keyType='ENTREZID')
        enrichKK 
      }
      ##最基础的条形图和点图
      #条带图
      barplot(enrichKK,showCategory=20)
      #气泡图
      dotplot(enrichKK)
      

      enrichKK.pngenrichKK.png

      • 通路与基因之间的关系可视化
      #通路与上调基因之间的关系可视化
      ###制作genlist三部曲:
      ## 1.获取基因logFC
      DEG_up <- DEG[DEG$g == 'UP',]
      geneList <- DEG_up$logFC
      ## 2.命名
      names(geneList) = DEG_up$ENTREZID
      ## 3.排序很重要
      geneList = sort(geneList, decreasing = TRUE)
      head(geneList)
      
      cnetplot(enrichKK, categorySize="pvalue", foldChange=geneList,colorEdge = TRUE)
      cnetplot(enrichKK, foldChange=geneList, circular = TRUE, colorEdge = TRUE)
      ggsave("enrichKK_cnetplot.png")
      

      enrichKK_cnetplot.pngenrichKK_cnetplot.png

      • 通路与通路之间的连接展示
      #通路与通路之间的连接展示
      emapplot(enrichKK)
      ggsave("enrichKK_emapplot.png")
      

      enrichKK_emapplot.pngenrichKK_emapplot.png

      • 热图展现通路与基因之间的关系
      #热图展现通路与基因之间的关系
      heatplot(enrichKK)
      ggsave("enrichKK_heatplot.png")
      

      enrichKK_heatplot.pngenrichKK_heatplot.png

      • 如果你是做GO数据库呢,其实还有一个goplot可以试试看,当然是以Y叔的书为主啦。
      #如果你是做GO数据库呢,其实还有一个goplot可以试试看
      ego_bp_up<-enrichGO(gene       = DEG_up$ENTREZID,
                       OrgDb      = org.Mm.eg.db,
                       keyType    = 'ENTREZID',
                       ont        = "BP",
                       pAdjustMethod = "BH",
                       pvalueCutoff = 0.01,#0.01
                       qvalueCutoff = 0.05)
      goplot(ego_up)
      ggsave("ego_bp_up_goplot.png")
      head(ego)
      library(stringr)
      barplot(ego_bp_up,showCategory = 16,title="The GO_BP enrichment analysis of all DEGs ")+ 
        scale_size(range=c(2, 12))+
        scale_x_discrete(labels=function(ego_bp) str_wrap(ego_bp,width = 25))
      ggsave("ego_bp_up_barplot.png")
      

      ego_up_goplot.pngego_up_goplot.png

      ego_up_barplot.pngego_up_barplot.png

      • 同样的方式看看下调基因的GO_BP:

        down_regulated_genes.pngdown_regulated_genes.png


      • 和文献中的GO_BP比较一下

        GO_BPGO_BP

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