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      • 了解ChIP-seq的实验流程

      了解ChIP-seq的实验流程

      • 发布者 weinfoeditor
      • 分类 生信星球
      • 日期 2020年3月27日
      测试开头

       今天是生信星球陪你的第578天


         大神一句话,菜鸟跑半年。我不是大神,但我可以缩短你走弯路的半年~

         就像歌儿唱的那样,如果你不知道该往哪儿走,就留在这学点生信好不好~

         这里有豆豆和花花的学习历程,从新手到进阶,生信路上有你有我!

      豆豆写于2020.3.27
      从头开始了解数据是如何出来的,才能对后来数据处理更加熟悉

      ChIP-seq的目的是研究感兴趣蛋白在基因组上的结合位点,可以用来鉴定转录因子(transcription factor, TF)的结合位点或者转录后更广范围的组蛋白修饰(histone marks),一般与调控元件有关。

      高通量测序(high-throughput sequencing ,HTS)2005年首次提出,平台包含了:二代测序Illumina/Solexa, Roche/454, SOLiD (ABI), Ion Torrent以及三代测序Pacbio(曾打算被illumina以12亿美元收购,但未成功), Oxford Nanopore。这里主要讨论illumina产出的数据(毕竟现在市场份额最大,2018年达到83.9%),其他平台也是类似,只不过在文库制备、测序的步骤有差别。

      染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation ,ChIP)技术诞生很早,由Orlando等人创立于1997年,发表于2000年,先利用Microarray技术 ChIP-chip,后2007年利用DNA sequencing技术 ChIP-seq。

      详细的实验步骤:

      • 交联染色质免疫沉淀的 ChIP 方案 (crosslinking/X-ChIP=》主流):https://www.abcam.cn/protocols/cross-linking-chromatin-immunoprecipitation-x-chip-protocol-2

      • 自然染色质免疫沉淀方案 (native/N-ChIP):https://www.abcam.cn/protocols/native-chromatin-immunoprecipitation-protocol

      染色质准备

      整个流程从福尔马林对染色质上的蛋白与DNA交联开始

      染色质是指间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA 组成的线性复合结构,是间期细胞遗传物质存在的形式

      染色体是指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中,由染色质聚缩而成的棒状结构。实际上,两者化学组成没有差异,而包装程度即构型不同

      这样就相当于拍了个照片,把基因组上分布的蛋白质和各种修饰定格下来

      然后,把交联的染色质进行超声裂解,一般破碎后的片段大小为200bp左右

      note:

      以上是采用交联的ChIP-seq(X-ChIP),如果是N-ChIP则采用微球菌核酸酶裂解染色质以获取DNA片段(一般会得到147bp左右的片段),这种方案一般用于组蛋白修饰;但对于其他转录因子的研究,如果交联方法使得抗原表位(就是抗原决定部位)被掩,不能被抗体识别,那么也可以使用N-ChIP去做;但真心不推荐使用N-ChIP去做转录因子的研究,因为它们和染色质的结合比较松散,而N-ChIP的方法可能会破坏这本来就松散的联系,丢失很多相关的DNA

      抗原表位指抗原表面上决定抗原特异性的化学官能基。抗原表位可被免疫系统(尤其是抗体、B细胞或者T细胞)识别。

      免疫沉淀

      接下来,与蛋白特异性结合的 或者 与感兴趣的修饰部位特异结合的 抗体就出动了。用来识别蛋白-DNA复合物并带它们出来(俗称“拉下来”)。而这些抗体本身是带有“标签”的(可以想象成:抗体一个头有一个磁铁N极,待他把蛋白-DNA复合物结合,完成任务后,总部使用另外的磁铁S极把这个抗体连同复合物一起救走)【术语是:be pulled down and enriched using beads binding to the antibody】

      救回来以后,要进行清洗(去掉那些没有特异性结合的),蛋白又被消化掉,剩下的DNA被收集纯化起来,准备建库和测序

      建库

      一般需要修补DNA的两端、加上接头,另外如果测序仪的一条lane需要测不同的样本,那么还需要为DNA加上用于区分样本的index 接头(方便测序结束后将reads归类)

      该加的都加好后,进行纯化和PCR扩增(保证测序上机浓度)。而扩增这里就是众所周知的引入偏差的一环,在保证上机浓度前提下,PCR扩增的循环数应该限制到越小越好。之后建好的文库,就要加载到测序仪的玻璃载片(术语:flow cell,和显微镜的玻璃载片很像)进行测序

      测序

      对DNA片段测序都是从5’测到3‘,接头也分正反(forward and reverse两种类型),它们也是随机连接到双链DNA片段上的;

      单端测序:可以从forward或者reverse任一个接头一端开始

      双端测序:从forward和reverse接头同时开始

      产生的测序读长(read,测序就像读书一样一字一句,所以产出的数据是名词read,翻译为读长)一般比文库制备的DNA片段要短(从两边向中间测,不过也不排除有测通的情况)

      总结

      A图就是实验步骤;B图是之后会介绍的数据处理步骤

      了解ChIP-seq的实验流程

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      测试结尾

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