了解ChIP-seq的实验流程

测试开头

今天是生信星球陪你的第578天

大神一句话，菜鸟跑半年。我不是大神，但我可以缩短你走弯路的半年~

就像歌儿唱的那样，如果你不知道该往哪儿走，就留在这学点生信好不好~

这里有豆豆和花花的学习历程，从新手到进阶，生信路上有你有我！

豆豆写于2020.3.27
从头开始了解数据是如何出来的，才能对后来数据处理更加熟悉

ChIP-seq的目的是研究感兴趣蛋白在基因组上的结合位点，可以用来鉴定转录因子（transcription factor, TF）的结合位点或者转录后更广范围的组蛋白修饰（histone marks），一般与调控元件有关。

高通量测序（high-throughput sequencing ,HTS）2005年首次提出，平台包含了：二代测序Illumina/Solexa, Roche/454, SOLiD (ABI), Ion Torrent以及三代测序Pacbio（曾打算被illumina以12亿美元收购，但未成功）, Oxford Nanopore。这里主要讨论illumina产出的数据（毕竟现在市场份额最大，2018年达到83.9%），其他平台也是类似，只不过在文库制备、测序的步骤有差别。

染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation ，ChIP）技术诞生很早，由Orlando等人创立于1997年，发表于2000年，先利用Microarray技术 ChIP-chip，后2007年利用DNA sequencing技术 ChIP-seq。

详细的实验步骤：

交联染色质免疫沉淀的 ChIP 方案 (crosslinking/X-ChIP=》主流)：https://www.abcam.cn/protocols/cross-linking-chromatin-immunoprecipitation-x-chip-protocol-2

自然染色质免疫沉淀方案 (native/N-ChIP)：https://www.abcam.cn/protocols/native-chromatin-immunoprecipitation-protocol

染色质准备

整个流程从福尔马林对染色质上的蛋白与DNA交联开始

染色质是指间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA 组成的线性复合结构，是间期细胞遗传物质存在的形式

染色体是指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质聚缩而成的棒状结构。实际上，两者化学组成没有差异，而包装程度即构型不同

这样就相当于拍了个照片，把基因组上分布的蛋白质和各种修饰定格下来

然后，把交联的染色质进行超声裂解，一般破碎后的片段大小为200bp左右

note：

以上是采用交联的ChIP-seq（X-ChIP），如果是N-ChIP则采用微球菌核酸酶裂解染色质以获取DNA片段（一般会得到147bp左右的片段），这种方案一般用于组蛋白修饰；但对于其他转录因子的研究，如果交联方法使得抗原表位（就是抗原决定部位）被掩，不能被抗体识别，那么也可以使用N-ChIP去做；但真心不推荐使用N-ChIP去做转录因子的研究，因为它们和染色质的结合比较松散，而N-ChIP的方法可能会破坏这本来就松散的联系，丢失很多相关的DNA

抗原表位指抗原表面上决定抗原特异性的化学官能基。抗原表位可被免疫系统（尤其是抗体、B细胞或者T细胞）识别。

免疫沉淀

接下来，与蛋白特异性结合的或者与感兴趣的修饰部位特异结合的抗体就出动了。用来识别蛋白-DNA复合物并带它们出来（俗称“拉下来”）。而这些抗体本身是带有“标签”的（可以想象成：抗体一个头有一个磁铁N极，待他把蛋白-DNA复合物结合，完成任务后，总部使用另外的磁铁S极把这个抗体连同复合物一起救走）【术语是：be pulled down and enriched using beads binding to the antibody】

救回来以后，要进行清洗（去掉那些没有特异性结合的），蛋白又被消化掉，剩下的DNA被收集纯化起来，准备建库和测序