关于 scale 函数和 pheatmap 的图例问题

问题

最近看见几个小伙伴在群里询问 pheatmap 绘制热图的相关问题：

• 数据离散度太大，热图趋势看不出来？
• 这个图例范围怎么调整？
• 我 scale 了呀，怎么热图还是对比不明显？

看法

1、数据离散度大，可以尝试将数据取 log2、log10 来缩小数据之间的差异，比如像用的 FPKM/RPKM/TPM 等表达量数据，然后再做个 scale（Z-score）处理应该就可以了。

当然如果用的 log2FoldChange 差异倍数的数据画，就不用这么做了。

2、pheatmap 图例是根据数据的范围来调整的，如果想自己定义显示范围和标签也是可以的。legend_breaks、breaks 和 legend_labels 三个参数互相配合调整即可。

3、如果你的数据已经 scale 了，但还是看不出 对比度 或者 表达趋势 ，说明可能有 异常值 存在，可以 设置图例范围 达到目的，或者 去除异常值。

scale 函数详解

pheatmap 函数里有个 scale 参数，可以指定是按行 scale 还是按列 scale，即：scale = 'row'/scale = 'col'。一般情况我们是想比较同一个基因在不同样本中的相对表达高低，而不关心该基因在这个样本里相对其它基因的表达水平，指定按行 scale 即可。

R base 包里也有个 scale 函数，基本上原理是一样的：

scale(x, # 数据，数值型
      center = TRUE, # 是否中心化，默认TRUE
      scale = TRUE # 是否标准化，默认TRUE
      )

所谓的 center 参数意思是中心化的意思，即每个数据减去数据的 均值 ，达到一个在 0 左右分布的数据。

scale 参数理解为是否标准化，有两种情况：

• 1、当 center = TRUE 时，scale 为 TRUE，计算公式为：中心化的数据除以数据的标准差（sd）。
• 2、当 center = FALSE 时，scale 为 TRUE，计算公式为：数据除以均方根（sqrt(sum(x^2)/(n-1))）。

我们具体实践看看，先模拟 center = TRUE,scale = TRUE 情况：

# center = TRUE,scale = TRUE
# 数据
d <- c(1:5)

# 减去均值
dm <- d - mean(d)
# 除以标准差
dm / sd(d)
[1] -1.2649111 -0.6324555  0.0000000  0.6324555  1.2649111
# scale
# 同时中心化和标准化
dcs <- scale(d,center = T,scale = T)
dcs
           [,1]
[1,] -1.2649111
[2,] -0.6324555
[3,]  0.0000000
[4,]  0.6324555
[5,]  1.2649111
attr(,"scaled:center")
[1] 3
attr(,"scaled:scale")
[1] 1.581139

可以看到我们手动算的和函数算的结果是一致的。

再看看 center = FALSE,scale = TRUE 情况：

# 数据除以均方根
st <- sqrt(sum(d^2)/(5-1))
d / st
[1] 0.2696799 0.5393599 0.8090398 1.0787198 1.3483997
# 标准化
ds <- scale(d,center = F,scale = T)
ds
          [,1]
[1,] 0.2696799
[2,] 0.5393599
[3,] 0.8090398
[4,] 1.0787198
[5,] 1.3483997
attr(,"scaled:scale")
[1] 3.708099

可以看到结果也是一样的。如果我们想在不中心化的数据里（center = F）之间用标准差（sd）来做标准化呢？你可以自己手动算：

# 手动算
d / sd(d)
[1] 0.6324555 1.2649111 1.8973666 2.5298221 3.1622777

画个图看看这些区别：

# 绘图展示

# 中心化
dc <- scale(d,center = T,scale = F)
# 标准化
ds <- scale(d,center = F,scale = T)
# 同时中心化和标准化
dcs <- scale(d,center = T,scale = T)

# 整合数据
da <- data.frame(name = c(rep('d',5),rep('dc',5),rep('ds',5),rep('dcs',5)),
                 value = c(d,dc,ds,dcs),
                 y = c(rep(1,5),rep(2,5),rep(3,5),rep(4,5)))
# 绘图
ggplot(da,aes(x = value,y = y,fill = name)) +
  geom_point(size = 7,shape = 21) +
  theme_bw(base_size = 14) +
  theme(legend.position = c(0.9,0.8)) +
  scale_fill_brewer(palette = 'Set1') +
  scale_y_continuous(breaks = seq(0,5,1)) +
  scale_x_continuous(breaks = seq(-2,5,1)) +
  annotate('text',x = 3,y = 1.3,label = 'Row data',size = 6) +
  annotate('text',x = 0,y = 2.3,label = 'center = T',size = 6) +
  annotate('text',x = 0.8,y = 3.3,label = 'scale = T',size = 6) +
  annotate('text',x = 0,y = 4.3,label = 'scale = T & center = T',size = 6)

绘制热图展示：

这里有个小 tips ，就是使用 ggplotify 这个包把 pheatmap 对象变成 ggplot 对象用来拼图：

# 加载R包
library(ggplotify)
library(patchwork)

# Create test matrix
test = matrix(rnorm(200), 20, 10)
test[1:10, seq(1, 10, 2)] = test[1:10, seq(1, 10, 2)] + 3
test[11:20, seq(2, 10, 2)] = test[11:20, seq(2, 10, 2)] + 2
test[15:20, seq(2, 10, 2)] = test[15:20, seq(2, 10, 2)] + 4
colnames(test) = paste("Test", 1:10, sep = "")
rownames(test) = paste("Gene", 1:20, sep = "")

# 绘制热图
p1 <- as.ggplot(pheatmap(test,main = 'none scale'))
p2 <- as.ggplot(pheatmap(test, scale = "row",main = 'scale = row'))
p3 <- as.ggplot(pheatmap(test, scale = "column",main = 'scale = column'))

# 拼图
p1 + p2 + p3 + plot_annotation(tag_levels = LETTERS[1:3])

pheatmap 图例调整

上图第一个图有个较大值 8，通过调整图例范围来显示较小的范围的值的对比变化。

显示特定范围：

# 原始数据
p4 <- as.ggplot(pheatmap(test,
         border_color = 'black',
         main = 'raw',
         color = colorRampPalette(colors = c("navy", "white", "firebrick3"))(50)))

# 显示-4到4
p5 <- as.ggplot(pheatmap(test,
                         border_color = 'black',
                         main = '-4-4',
                         color = colorRampPalette(colors = c("navy", "white", "firebrick3"))(length(seq(-4,4,by = 0.1))),
                         breaks = seq(-4,4,by = 0.1),
                         legend_breaks = seq(-4,4,1)))
# 显示-8到8
p6 <- as.ggplot(pheatmap(test,
                   border_color = 'black',
                   main = '-8-8',
                   color = colorRampPalette(colors = c("navy", "white", "firebrick3"))(length(seq(-8,8,by = 0.1))),
                   breaks = seq(-8,8,by = 0.1),
                   legend_breaks = seq(-8,8,2)
                   ))

# 拼图
p4 + p5 + p6 + plot_annotation(tag_levels = LETTERS[1:3])

以上是对于原始数据的展示，对于 scale 后的数据同样可以：

# scale = 'row'
p7 <- as.ggplot(pheatmap(test,
                         border_color = 'black',
                         scale = 'row',
                         main = 'scale = row',
                         color = colorRampPalette(colors = c("navy", "white", "firebrick3"))(50)))
# -1-1
p8 <- as.ggplot(pheatmap(test,
                         border_color = 'black',
                         scale = 'row',
                         main = '-1-1',
                         breaks = seq(-1,1,by = 0.1),
                         legend_breaks = seq(-1,1,0.5),
                         color = colorRampPalette(colors = c("navy", "white", "firebrick3"))(length(seq(-1,1,by = 0.1)))))

# 拼图
p7 + p8 + plot_annotation(tag_levels = LETTERS[1:2])

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