MCT4依赖的乳酸分泌抑制LKB1缺陷肺腺癌的抗肿瘤免疫

Qian等人发现，在STK11/LKB1突变型肺腺癌(LUAD)中，乳酸分泌增强在促进免疫治疗耐药表型中起关键作用。他们证明，通过MCT4乳酸转运体增加的乳酸分泌可促进M2巨噬细胞极化并抑制T细胞功能，并且靶向MCT4可改善STK11/LKB1突变肿瘤对免疫检查点阻断的应答。

背景

STK11/LKB1基因的缺失或失活突变广泛存在于肺腺癌和鳞状细胞癌中，约占病例的20%和2-19%。这些突变通常与KRAS基因突变共存（称为KL肿瘤），共同表现出与更侵袭性癌症表型相关的特定生物学特征。尽管免疫检查点阻断疗法革新了癌症治疗并广泛应用于不同恶性肿瘤，但KL肿瘤对免疫疗法具有抵抗性。相反，在LKB1功能完整的情况下，免疫疗法对带有KRAS突变（K）或KRAS和TP53共突变（KP）的非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤是有效的。LKB1的丧失被认为是“冷”型肿瘤免疫微环境（TIME）的重要驱动因素，其特征为T细胞浸润有限、免疫检查点分子PD-L1的表达低以及中性粒细胞和髓系抑制细胞（MDSCs）的增加。实验模型证实LKB1缺乏导致免疫抑制性趋化因子和细胞因子的分泌，例如VEGF、IL-6、TGF-b和CXCR2配体。

LKB1是14个AMPK相关激酶的主要调节因子。最近，盐诱导激酶（SIKs）被鉴定为LKB1的关键底物，抑制肺肿瘤形成并调节基因表达。重要的是，LKB1的丧失与代谢重编程相关，并与KRAS突变协同作用，激活缺氧、糖酵解以及谷氨酸和丝氨酸代谢，通过上调HIF-1a或KEAP1-NRF2等关键基因。此外，KL肿瘤细胞过表达尿素循环酶碳酰磷酸合成酶-1（CPS1），导致氮流入嘧啶以支持细胞生长。KL肿瘤代谢表型的改变对TIME的影响尚不明确，并可能导致观察到的肿瘤免疫抑制表型。

乳酸单羧酸转运蛋白4（MCT4，也称为溶质载体家族16成员3或SLC16A3）在缺氧条件下被HIF-1a上调，并被认为是乳酸通过细胞膜的主要介导者，维持糖酵解的流动非常重要。MCT4在多种癌症中过度表达，包括非小细胞肺癌，且被视为独立的负面预后因子。然而，增强的乳酸产生和MCT4介导的乳酸分泌对肿瘤进展以及对TIME的影响，尤其是在KL肿瘤中，尚不清楚。

研究探究了LKB1缺失对肿瘤免疫浸润和免疫检查点阻断（ICB）无反应的生物学后果。作者发现LKB1缺失显著影响肿瘤的代谢，增强了糖酵解以及乳酸的产生和分泌，这些效应依赖于乳酸转运蛋白MCT4的上调。作者的研究表明，LKB1缺失肿瘤显示出CD8⁺ T细胞的免疫浸润减少，但M2巨噬细胞极化增强。

作者的发现表明，LKB1缺失肿瘤中增强的乳酸分泌导致M2巨噬细胞极化，敲除MCT4部分耗尽了促肿瘤的M2巨噬细胞，并在体内增强了ICB抗肿瘤治疗的反应。总的来说，作者的数据提示，抑制MCT4是克服LKB1缺失肿瘤中惰性肿瘤免疫微环境的一种有希望的治疗策略，并可能提高这类患者群体中免疫检查点阻断的临床疗效。

摘要

STK11/LKB1突变是肺腺癌(LUAD)免疫治疗中原发性耐药的关键因素，其潜在机制尚不清楚。笔者发现LKB1的缺失会导致MCT4转运体产生从而导致乳酸分泌增加。小鼠模型的单细胞RNA分析表明，LKB1缺陷肿瘤中M2巨噬细胞极化和功能低下的T细胞增加了，这些影响可以通过添加外源性乳酸来重现，并通过敲除MCT4或治疗性地阻断免疫细胞上表达的乳酸受体GPR81来消除。此外，在同基因小鼠模型中，MCT4敲除逆转了LKB1缺失诱导的PD-1阻断的抗性。研究表明，STK11/LKB1突变肺腺癌LUAD患者的肿瘤表现出相似的表型，即M2 –巨噬细胞极化增强和T细胞功能低下。这些数据提供了乳酸抑制抗肿瘤免疫的证据，并且该途径的治疗靶向是逆转STK11/LKB1突变体，从而对肺腺癌免疫治疗耐药的治疗策略。

机制图werwew

结果

1.缺乏LKB1会增加乳酸分泌

为了进一步了解LKB1缺失的影响，作者对小鼠Kras突变（LKR13 K）和Kras突变/LKB1缺失（LKR13 KL）同种移植肿瘤模型进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。先前的研究报道LKB1缺失肿瘤显示出增强的糖酵解速率。与此一致，作者对这些肿瘤群体进行的基因集变异分析（GSVA）显示，与K肿瘤相比，KL肿瘤中与糖酵解、E2F特征和血管生成相关的基因明显富集（图S1A）。随后的研究使用小鼠同种移植LKR13/LKR10和人源（A549、H460、H23和H2030）肺腺癌模型的等基因对（+/−LKB1表达）进行。恢复LKB1表达显著降低细胞外酸化速率（ECAR）并增加耗氧速率（OCR）（图1A和1B），而LKB1敲低则降低了OCR（图S1B）。然而，使用5-氨基咪唑-4-羧酰胺核苷（AICAR）来激活LKB1下游的关键代谢调节因子AMPK显示，LKB1缺失细胞的OCR和ECAR均减少，提示代谢变化并非完全依赖于AMPK（图S1C）。

作者接下来评估了LKB1缺失对LUAD肿瘤细胞乳酸产生的影响。之前的研究结果和癌细胞系百科全书（CCLE）的代谢组学分析表明，LKB1缺失肿瘤样本和细胞系的乳酸水平升高（图S1D和S1E）。

此外，作者发现LKB1缺失肿瘤细胞产生的细胞外乳酸水平高于其LKB1功能正常的等基因对应细胞，而LKB1敲低在H441 LKB1功能正常细胞中显著增加了乳酸的分泌（图1C和1D）。此外，LKB1缺失显著降低了细胞内pH值（图1E）。

图1

2.LKB1缺乏诱导代谢改变，增加糖酵解、乳酸输出和MCT4表达

MCT4在乳酸转运中发挥关键作用，并且与正常组织相比，在LUAD肿瘤中上调表达（图S1F）。

因此，作者试图确定LKB1是否调节MCT4的表达。在一系列KL和KP细胞系中观察到MCT4的表达水平存在差异（图S1G）。

更重要的是，重新表达LKB1（而非激酶失活的LKB1）在LKB1缺失细胞系中降低了MCT4的表达（图1F–1G，图S1H）。类似地，作者发现在带有线粒体NADH脱氢酶突变的KP细胞系H358中敲低LKB1增加了MCT4的表达，而在H2009中未观察到此现象（图S1I）。在LKR13和LKR10小鼠模型中也观察到类似结果，LKB1缺失肿瘤细胞中MCT4表达增加（图1H）。

此外，来自逆相蛋白质组学阵列（RPPA）的蛋白表达数据一致地显示LKR13KL细胞中MCT4的表达显著上调（图S1J）。从癌症基因组图谱（TCGA）队列中，作者还观察到LKB1突变肿瘤中MCT4 mRNA表达显著上调（图S1K）。此外，通过流式细胞术评估人类和小鼠等基因对细胞系，作者发现细胞表面MCT4的表达也增加（图1I）。

为了研究LKB1功能正常和缺失肿瘤中MCT4的表达情况，作者评估了K和KL基因工程小鼠模型（GEMMs）和同种移植肿瘤模型的肿瘤组织中的MCT4表达。免疫组织化学染色显示KL肿瘤中MCT4的水平显著增加（图1J和图S1L）。

图S1

3.敲除MCT4会损害LKB1缺陷细胞的乳酸分泌和细胞活力

为了探索MCT4在LKB1缺失肿瘤中细胞生长和代谢中的功能，作者使用CRISPR/Cas9基因编辑技术在LKR13、LKR10 K和KL细胞系中敲除了MCT4基因（MCT4-KO）。MCT4的丧失减少了K和KL细胞的细胞存活率（图2A、2B和图S2A），尽管KL细胞受到的影响较小。与其在乳酸转运中的作用一致，MCT4的减少导致细胞外乳酸水平降低和细胞内乳酸积累增加（图2C和图S2B）。作者通过免疫荧光和流式细胞术评估了MCT4 KO后的细胞内pH值，发现MCT4KO的细胞内pH显著降低（图2D和2E）。此外，通过ECAR和OCR定量分析，作者发现MCT4丧失导致糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）速率显著降低（图2F和图S2C）。为了进一步评估细胞能量产生是否依赖于MCT4，作者将ECAR和OCR测量值转换为之前描述的ATP产生速率。K和KL肿瘤细胞的最大糖酵解能力类似。然而，与母细胞K细胞相比，KL细胞的线粒体呼吸能力显著降低（矩形框表示最大生物能量潜力，图S2D）。K细胞和KL细胞的糖酵解产生的ATP（JATP gly）和氧化磷酸化产生的ATP（JATP oxphos）类似，但KL细胞更依赖于糖酵解。符合预期，MCT4敲除显著影响了糖酵解和氧化磷酸化的ATP产生（图S2E），以及最大产能（图S2F和图S2G）。综合这些结果表明，LKB1缺失增强了MCT4的表达，促进了细胞存活率、ATP产生以及细胞外乳酸积累和酸化。

图2

图S2

4.MCT4敲除可消除LKB1缺陷肿瘤中诱导的M2巨噬细胞极化

鉴于乳酸已知会影响肿瘤微环境中的不同细胞类型，作者接下来探究与LKB1缺失和MCT4过表达相关的代谢重编程是否对惰性肿瘤免疫微环境（TIME）起作用。为此，作者分析了K、KL和KL MCT4KO同种移植肿瘤的单细胞RNA测序数据。每种免疫细胞亚群都经过了充分的表征，根据已知的细胞类型标记和免疫基因组计划（ImmGen）数据集的评估。在免疫亚群中，单核/巨噬细胞谱系占比最高（图S3A），尽管具体的单核/巨噬细胞表型受到了LKB1和MCT4的消耗的显著影响。除了巨噬细胞外，KL肿瘤中还显著富集了一部分功能减弱的T细胞亚群，但在KL MCT4-KO肿瘤中出现逆转现象（图S3A）。

具体而言，K肿瘤中的巨噬细胞显示出较高的M1得分，而KL肿瘤则极化为更高的M2特征得分。LKB1缺失引起的这些变化在MCT4敲除（KL MCT4-KO）后得以逆转，与LKB1功能正常的K细胞类似，KL MCT4-KO细胞具有较高的M1特征得分28（图3A和图3B），支持了MCT4在介导LKB1缺失引起的M2极化中的作用。通过对所示特征基因所代表的巨噬细胞进一步分析，发现了六个不同的聚类（图3C，附表S1）。Arg1作为M2巨噬细胞的标记，在除了单核细胞聚类（c3）之外的所有聚类中均有表达（图S3B），表明肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）显示普遍的M2表型。为了进一步探索这些聚类的表型，作者评估了所有六个聚类中的M2和M1得分（图S3D）。在这些聚类中，聚类0（c0）显示出较高的M2得分，并且以Vegfa、增强的精氨酸代谢和IL8的高表达为特征（图S3B和图S3C）。先前的研究已报道该细胞群促进血管生成和肿瘤进展。相反，c2表达Arg1和Il1b，但不表达许多其他巨噬细胞标记物31，而c3和c5显示出较高的M1得分。与K肿瘤相比，KL肿瘤特别富集了c0，并且c2水平较低。

相反，KL MCT4-KO肿瘤逆转了KL肿瘤中的这些变化，与KL肿瘤相比，c0减少而c2增加（图3D），c3聚类也增加。因此，KL肿瘤中的M2/M1比例高于K肿瘤或KL MCT4-KO肿瘤（图3E）。在其他聚类中，包括Spp1⁺（c4）或Egr1⁺炎性（c5）巨噬细胞中没有明显变化。

然后，作者使用小鼠同种移植模型通过免疫荧光法评估了M1和M2巨噬细胞。与K肿瘤相比，KL肿瘤中M2巨噬细胞（F4/80⁺ ARG1⁺细胞）水平显著增加，而M1巨噬细胞（F4/80⁺ iNOS⁺细胞）水平显著降低，而这些变化在LKR13和LKR10模型中通过MCT敲除得到了逆转（图3F、图S3E）。为了验证增强的M2极化与肿瘤位置（如皮下和肺部）无关，作者分析了携带KrasG12D或KrasG12D；Stk11 fl/fl等位基因的GEMM肺部肿瘤，结果确认KL肿瘤中M2巨噬细胞水平较高，而M1巨噬细胞水平较低（图S3F）。

图3

图S3

5.KL条件培养基在体内以依赖MCT4的方式促进M2极化。

接下来，作者假设LKB1缺失促进的m2极化表型至少部分归因于这些肿瘤分泌的因子。为了验证这一点，作者在小鼠皮下植入K、KL或KL MCT4-KO肿瘤细胞条件培养基的明胶海绵32，并在14天后评估巨噬细胞的浸润和极化情况。

在含有kl条件培养基的明胶海绵中，M2巨噬细胞的相对丰度明显高于单独含有K的海绵，而M1巨噬细胞的相对丰度则相反(图4A)。这些由LKB1缺失引起的变化可以通过敲除MCT4来逆转。这些数据提供了证据，证明LKB1缺失诱导的M2极化至少部分是由肿瘤细胞分泌的因子诱导的，这些变化依赖于乳酸转运体MCT4，与乳酸促进M2极化的潜在作用一致。

图4

6.抑制乳酸– MCT4通路可消除LKB1缺乏引起的M2极化*

基于前面的观察以及早期的研究表明乳酸可以诱导M2极化，作者假设KL细胞中向M2极化的MCT4依赖性转变可能是由于乳酸分泌增强所致。为了更直接地测试乳酸-MCT4通路对体外巨噬细胞极化的影响，作者利用已建立的Raw264.7巨噬细胞系和新鲜分离的腹腔原代巨噬细胞系统。如预期，原代巨噬细胞表达了包括CD11b和CD11c在内的巨噬细胞标记物（图S4A）。然后将这些细胞与来自K、KL和KL MCT4-KO肿瘤细胞的对照培养基或条件培养基（CM）共培养。通过流式细胞术分析CD206⁺细胞，作为M2极化表型的反映，显示当巨噬细胞与KL条件培养基共培养时，M2极化增加，但与K或KL MCT4-KO培养基相比没有此效应。此外，直接添加乳酸到KL MCT4-KO条件培养基中显著增加了M2巨噬细胞的百分比，而丙酮酸或盐酸，这两者都能诱导类似的pH变化，却没有这样显著的效应（图4B和图S4B），表明这些变化并不仅仅是pH依赖的。

接下来，作者测试了使用3-Oba（β-羟丁酸）抑制存在的乳酸受体GPR81对乳酸作用的拮抗效果。GPR81的抑制逆转了KL条件培养基引起的M2极化（图4B）。

原代巨噬细胞也得到了类似的结果（图S4B）。此外，Boyden室内迁移实验显示，与与K或KL MCT4-KO条件培养基孵育的巨噬细胞相比，与KL培养基共培养时巨噬细胞迁移增强（图4C和图S4C）；这种KL细胞中的迁移增强可以通过3-Oba抑制。吞噬作用被报道为部分支持抗原呈递37。作者观察到KL肿瘤细胞的条件培养基或添加乳酸的培养基会降低巨噬细胞的吞噬作用（图4D和图S4D），而3-Oba或MCT4-KO条件培养基可以逆转这种效应。作者还研究了巨噬细胞极性的其他标记物，并发现与KL条件培养基共培养后M2标记物（Mcp1和Mrc1）的RNA水平增加，而MCT4敲除逆转了这种效应，而M1标记物则显示相反的趋势（图4E和图S4E）。

此外，先前的研究表明ERK1/2信号与M2巨噬细胞相关，而STAT1信号与M1巨噬细胞相关。作者还发现KL肿瘤细胞的条件培养基或乳酸可以诱导巨噬细胞中ERK1/2的激活，但不会诱导STAT1的激活（图S4F）。作者还观察到KL条件培养基或乳酸处理后Raw264.7细胞上PD-L1的表达增加（图S4G）。接下来，作者评估了极化的巨噬细胞对T细胞的杀伤效果。Raw264.7细胞进行了处理，并且在与KL条件培养基共培养的情况下，这些巨噬细胞的杀伤能力显著降低。

将Raw264.7细胞与添加了3-Oba、乳酸或乳酸钠的条件培养基（CM）共培养两天。然后，使用表达LKR13K-SIINFEKL的细胞作为靶细胞，并与巨噬细胞共同培养过夜。随后加入OT-I T细胞，并在6小时后评估细胞杀伤作用。KL CM或乳酸处理促进了巨噬细胞的免疫抑制表型，抑制了T细胞的细胞毒作用，而MCT4-KO CM处理逆转了这种效应（图4F，图S4H）。

LKB1缺陷还与CXCL2和IL6等趋化因子的表达增加相关。为了进一步研究乳酸的效应，作者对K、KL和KL MCT4-KO肿瘤细胞的CM进行了变性处理，以失活生物活性蛋白因子。或者，作者用透析法滤除了CM中的低分子量（<3 KD）代谢产物。乳酸和TGF-b被用作阳性对照。变性的KL CM或外源性乳酸增加了Raw264.7细胞上CD206的表达，而滤过的培养基则没有这种效应（图4G）。类似地，变性的KL CM保留了增加M2相关mRNA基因表达和减少M1相关基因的能力，而滤过的CM则没有这种效应（图4H，图S4I）。

综上所述，这些发现进一步证明与LKB1缺失相关的乳酸分泌增强促进了有利于肿瘤生长的M2巨噬细胞极化，这种效应可以通过敲除乳酸转运体MCT4或阻断乳酸受体来逆转。

图S4

7.敲除MCT4可恢复CD8⁺ T细胞对肿瘤细胞的活性

作者接下来研究了T细胞低功能是否也至少部分通过乳酸-MCT4途径介导。作者将OT-I T细胞和LKR13K-SIINFEKL靶细胞与K、KL或KL MCT4-KO细胞的条件培养基共培养。与K细胞的条件培养基相比，KL细胞的条件培养基存在显著较少的T细胞诱导的靶细胞凋亡（图5A，p = 0.002）；当使用携带MCT4-KO的KL细胞的条件培养基时，这种T细胞介导的凋亡抑制在很大程度上被消除（图5A，p = 0.006，图S5A）。作者随后研究了乳酸在这种T细胞功能抑制中的作用。在KL MCT4-KO培养基中添加外源性乳酸显著抑制了T细胞介导的凋亡（p = 0.032）。此外，KL CM或乳酸降低了IFN-g⁺ T细胞的百分比（图5B），以及IFN-g的释放（图S5B）。进一步的分析表明，KL CM中的乳酸，而不仅仅是pH的改变，抑制了T细胞的细胞毒作用和IFN-g的产生（图5C，图S5C-S5E）。值得注意的是，KL CM的抑制效应也可以被3-Oba逆转（图5C和图S5E）。

此外，富含乳酸的培养基以及KL培养基，而不是KL MCT4-KO培养基，显著降低了T细胞的PD-1表达和增殖（图S5F-S5G）。作者进一步将T细胞与K、KL和KL MCT4-KO的变性或滤过的CM共培养，观察到乳酸或变性的KL CM抑制了T细胞的功能。滤过的KL CM也抑制了T细胞介导的细胞杀伤，但其效应低于变性的CM（图5D，图S5H）。先前的研究还指出，肿瘤微环境中的高乳酸可能通过抑制T细胞激活期间的糖酵解来减弱T细胞功能。在这里，作者观察到KL CM中T细胞的ECAR降低，而MCT4-KO或3-Oba可以逆转这种效应（图5E），这表明抑制乳酸途径可以恢复T细胞的代谢和功能。

综上所述，这些数据表明乳酸/MCT4途径在LKB1缺失导致的T细胞功能抑制中起到了一定作用。

图5

8.MCT4敲除可恢复KL肿瘤中细胞毒性CD8⁺ T细胞群

除了体外实验结果外，作者还从单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据中进一步观察到KL肿瘤中的T细胞表现出高度耗竭和STAT3信号传导，而MCT4-KO肿瘤显示相反的表型和增加的PD-1/PD-L1通路（图5F）。作者进一步利用T细胞激活基因表达谱的优势，发现MCT4-KO增加了一些基因的表达水平，如Tigit、Cxcl9和Cd274（图S5I）。

重要的是，作者的分析显示KL肿瘤中低功能T细胞的比例增加，而MCT4-KO可以逆转这种增加（图5G，图S5J和表S2），这类T细胞对免疫疗法的反应减弱。作者还调查了来自三种类型肿瘤的CD8⁺ T细胞中的检查点/刺激基因的表达，以评估它们的激活状态（图S5K）。表达刺激剂Gitr（Tnfrsf18）/4-1bb（Tnfrsf9）和检查点基因Pd1/Tigit的CD8⁺ T细胞的比例较高，表明K肿瘤中具有活化表型。然而，在KL肿瘤中，超过50%的CD8⁺ T细胞显示较低的共表达。这种表型在KL MCT4-KO肿瘤中部分逆转（图5H）。

总之，这些数据表明，在LKB1缺失肿瘤的免疫微环境中乳酸增加对CD8⁺ T细胞功能产生负面影响，并且将治疗策略集中于抑制肿瘤乳酸分泌可能增强细胞毒性T细胞的活性。

图S5

9.MCT4缺失使LKB1缺陷肿瘤对免疫检查点阻断治疗增强

上述数据提供了证据，即LKB1缺失通过MCT4导致乳酸分泌增加，而乳酸-MCT4途径对巨噬细胞极化和T细胞功能均产生影响。为了测试MCT4-KO对肿瘤生长的影响以及是否可通过免疫细胞效应来解释，作者在免疫缺陷和免疫能力正常的小鼠中注射LKR13K和LKR13KL细胞（图6A和6B）。在LKB1缺失的LKR13KL细胞中，MCT4-KO在免疫能力正常的小鼠中显著抑制肿瘤生长，但在免疫缺陷的小鼠中没有这种效应（图6A），支持MCT4-KO的效应与抗肿瘤免疫有关。然而，在LKB1完整的小鼠中，LKR13K的生长减缓在免疫能力正常和免疫缺陷的模型中都观察到，而MCT4-KO在两种模型中都略微减少了肿瘤生长（图6B），这表明MCT4-KO的影响不依赖于抗肿瘤免疫。

作者进一步探讨了MCT4-KO与ICB联合治疗的效果。在具有完整LKB1的K肿瘤中，对抗PD-1的治疗对肿瘤生长没有显著抑制作用，而MCT4-KO显著减少了肿瘤生长（图6C）。然而，在LKB1缺失的肿瘤中，这些肿瘤对PD-1抑制剂耐药，9,12，而MCT4-KO恢复了对抗PD-1治疗的响应，显著减少了肿瘤生长（图6D），并且明显延长了生存时间（图6E），相比于接受对照抗体治疗的LKB1缺失肿瘤小鼠。使用独立的小鼠肿瘤模型，包括LKR10和344sq（具有Kras/Tp53突变），得到类似的结果（图6F–6I）。在LKR10模型中，接受MCT4-KO的LKR10 KL肿瘤小鼠中的18只中，有6只在随机分组后的60天内完全消退了肿瘤，而KL肿瘤接受抗PD-1治疗的16只小鼠中没有出现完全消退（图S6A）。完全消退的LKR10 KL MCT4-KO肿瘤的小鼠在肿瘤消退后4周，接受数量为先前注射肿瘤细胞数量4倍的二次接种。所有再接种的小鼠在10天后相比于未经处理的对照小鼠显示了肿瘤生长抑制（图S6B），表明存在强有力且持久的抗肿瘤免疫。

为了进一步验证在MCT4-KO肿瘤中抑制肿瘤生长的关键因素是T细胞，作者使用抗CD8抗体去除了MCT4-KO肿瘤小鼠中的CD8⁺ T细胞，并进行了抗PD-1治疗（图S6C）。作者观察到去除CD8⁺ T细胞完全消除了ICB的效果，并且加速了肿瘤生长（图S6D）。此外，MCT4-KO肿瘤显示出较低的血清乳酸/葡萄糖比，表明MCT4-KO抑制了体内乳酸的排泄（图S6E–S6G），但肿瘤内乳酸/葡萄糖水平没有显著差异（图S6H–S6I）。

综上所述，作者的发现表明：（i）LKB1缺失导致通过MCT4增加乳酸分泌；（ii）KL介质中增加的乳酸促进了M2型巨噬细胞极化并损害了T细胞功能；（iii）MCT4敲除或使用Oba阻断GPR81逆转了免疫抑制表型；（iv）KL介质诱导的免疫抑制表型可以通过外源性乳酸重现，但不能通过变性处理来逆转。这些数据支持MCT4的阻断和乳酸代谢干预作为一种有希望的治疗策略，可以增强LKB1缺失LUAD患者中免疫检查点抑制疗法的抗肿瘤免疫应答（图6J）。

图6

图S6

10.LKB1丢失与LUAD患者T细胞浸润和M2极化减少有关

为了调查在LKB1缺失肿瘤的小鼠模型中观察到的结果是否与患者中的变化相一致，作者评估了来自非小细胞肺癌免疫基因组分析（ICON）队列（n = 148，图7A）的免疫细胞相对丰度和定位，使用了荧光多重免疫组织化学（IHC）。作者观察到与LKB1缺失相关的低免疫细胞浸润，包括肿瘤和基质部位的CD3⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和CD68⁺髓系细胞的减少（图7B–7D，S7A和S7B）。然后，作者利用PROSPECT MDACC数据集（n = 152，其中包括44例LKB1缺失和108例LKB1完整）的基于阵列的表达谱数据，并进行CIBERSORT分析，以量化巨噬细胞和其他免疫细胞的比例。与IHC数据一致，作者观察到LKB1缺失肿瘤中CD8⁺ T细胞的比例与LKB1野生型（WT）肿瘤相比呈下降趋势（图7E，p = 0.073）。此外，LKB1缺失肿瘤的M1巨噬细胞的肿瘤免疫浸润显著低于LKB1 WT肿瘤（图S7C）。相反，在LKB1 WT和LKB1缺失肿瘤之间的替代活化的M2巨噬细胞群体中没有显著差异，导致LKB1缺失肿瘤样本中主要存在高M2比率（中位数= 0.78，范围从0到1，与中位数= 0.69，范围从0.22到1相比，图7F）。此外，更高的M2比率与CD8⁺ T细胞呈负相关（图S7D）。TCGA LUAD队列中进行的CIBERSORT分析显示了类似的趋势，M2比率略微增加，并与CD8⁺ T细胞呈负相关（图S7E和S7F）。为了进一步验证这一发现，作者研究了16名KRAS突变LUAD患者的scRNA-seq数据，并确定了11个髓样细胞群体（图7G）。群体1和群体8根据关键差异表达标记物（CD163、MRC1、MARCO和TGFB1）确定为M2巨噬细胞。重要的是，作者观察到STK11突变与M2巨噬细胞的中位数水平的增加相关联（图7H）。虽然样本量有限，但观察结果与KRAS LUAD中带有STK11突变的群体向M2极化的转变是一致的。

接下来，作者评估了TCGA LUAD中LKB1突变亚组中MCT4表达与M2巨噬细胞和CD8⁺ T细胞的关系。MCT4的表达与M2巨噬细胞水平呈正相关，但与CD8⁺ T细胞呈负相关（图7I）。然而，在CD8⁺ T细胞浸润较高的LKB1突变患者中，作者观察到高MCT4表达与较差的总生存率显著相关，而在CD8⁺ T细胞浸润较低的患者中未观察到这种相关性（图7J）。

综上所述，这些结果表明LKB1缺失与较低的T细胞免疫浸润和功能以及肿瘤促肿瘤性M2巨噬细胞极化相关联，并且与MCT4表达有关。

图7

图S7

讨论

以针对PD-1-PD-L1轴的免疫治疗药物已经改变了非小细胞肺癌的治疗格局，但大多数患者存在初级耐药性，免疫检查点抑制剂（ICB）单药的客观反应率在10-30%的范围内。初级耐药性与PD-L1水平低以及EGFR和ALK等一些驱动致癌基因有关。作者小组和其他研究人员的最新研究先前已经证明，在LUAD中，STK11/LKB1的变异与免疫抑制表型以及对ICB的初级耐药性有关，即使在具有高PD-L1表达或肿瘤突变负担（TMB）的患者中也是如此，并且是与“冷”免疫表型最密切相关的基因组标记。鉴于其作为免疫治疗耐药性的潜在驱动因素的重要性，有迫切的需求更好地阐明这种ICB耐药性的机制，并制定合理的治疗方法来克服它。在这里，作者研究了LKB1缺失引起的代谢变化的影响，并确定了MCT4依赖的乳酸分泌作为这种免疫抑制的介质，至少部分通过其对M2极化和效应性CD8⁺ T细胞功能的影响。这种机制在其他具有类似低免疫治疗应答率的LUAD亚组中没有观察到，例如EGFR突变患者。因此，作者的研究强调了乳酸-MCT4通路是这些治疗选择有限的患者的相关治疗靶点。

LKB1蛋白被认为是细胞代谢和生长的主要调控因子，通过调节下游激酶（包括AMPK和SIKs）发挥其作用。缺乏LKB1表达的肿瘤经历代谢重编程，表现为增加的糖酵解速率和对谷氨酰溶解的依赖。几项研究报告显示，LKB1-AMPK轴的失调促使代谢切换到有氧糖酵解，与增强的乳酸产生和分泌相关，这在LKB1缺失的肿瘤中得到证实。与先前的研究一致，作者发现LKB1缺失导致乳酸分泌显著上调，同时伴随着向更高的糖酵解、较低的氧耗和减少的氧化磷酸化表型的代谢转变。值得注意的是，利用同系人类和小鼠细胞以及基因工程小鼠模型，作者还发现LKB1缺失与MCT4的上调相关，MCT4是两种主要转运蛋白之一（另一个是MCT1），已知它们促进乳酸分泌、糖酵解、肿瘤细胞浸润、转移和肿瘤生长，并与非小细胞肺癌和其他实体肿瘤的不良预后相关。突显其在这些代谢变化中的重要性，作者发现MCT4的耗竭基本上消除了LKB1缺失引起的细胞外乳酸增加，并导致细胞内乳酸增加和细胞内pH降低。有趣的是，尽管MCT1在某些癌症中已被发现上调，作者观察到LKB1缺失后MCT4上调，而MCT1未上调。最近的研究表明，MCT4表达与线粒体NADH脱氢酶（ND）突变相关。作者观察到，在携带突变ND的H358细胞中，MCT4高度表达，并且LKB1的沉默没有进一步增加MCT4表达，这表明LKB1对MCT4的影响在具有野生型ND的细胞中最为显著，并且ND突变可能是MCT4表达的主要调控因子。

鉴于乳酸已知具有免疫抑制作用，作者接下来研究了MCT4/乳酸通路在LKB1缺失肿瘤中观察到的ICB抵抗和免疫抑制表型中的作用。先前的研究表明，乳酸诱导的M2巨噬细胞极化，调节骨髓来源抑制性细胞（MDSCs）和T细胞功能，并且乳酸受体GPR81的抑制促进炎症性巨噬细胞反应。首先，作者利用单细胞RNA测序和使用SIINFEKL肽表达的肿瘤细胞进行功能研究，发现在免疫能力的KRAS突变小鼠模型中，LKB1缺失导致巨噬细胞表型明显向M2极化转变，这一观察结果得到了作者对携带WT或STK11/LKB1突变的LUAD患者临床标本的分析的支持。这些数据突显了这些肿瘤免疫表型的一个以前未被重视的方面，已有研究报告显示它们具有较低水平的T细胞浸润、PD-L1、IFN-g信号传导、干扰素基因刺激剂（STING）的表达以及较高水平的粒细胞源性骨髓抑制性细胞（GMDSCs）和IL-6等免疫抑制性细胞因子。

基于单细胞RNA测序和使用SIINFEKL肽表达的肿瘤细胞的功能研究，作者还观察到不仅CD8⁺ T细胞水平较低，而且存在功能低下的CD8⁺ T细胞或T细胞衰竭的迟期阶段迹象，这些变化也可以通过MCT4基因敲除而逆转。这种功能低下或衰竭的T细胞表型与ICB治疗效益降低相关。综合其他近期的研究，这些数据支持了一个模型，即LKB1介导的免疫抑制涉及多种免疫亚群，包括M2极化的增加以及效应性CD8⁺ T细胞数量和功能的抑制。

然后，作者调查了这些变化是否依赖于乳酸/MCT4通路。MCT4基因敲除能够逆转小鼠模型中观察到的M2极化现象，以及使用LKB1缺失细胞的体外条件培养基所观察到的现象。

使用乳酸受体GPR81的调节剂也观察到了类似的变化。虽然目前还没有GPR81抑制剂可用，但几项研究显示，与GPR81基因敲除相比，3-Oba治疗具有等效的效果，这表明使用3-Oba来抑制乳酸介导的GPR81激活是可行的。MCT4基因敲除和GPR81抑制还逆转了部分LKB1缺失引起的T细胞亚群的效应，如降低功能低下T细胞的数量。更重要的是，在三种完全对PD-1抑制无效的LKB1缺失小鼠LUAD模型中，MCT4基因敲除恢复了对PD-1抑制的敏感性，使其达到与LKB1完整肿瘤类似的水平，这支持了乳酸/MCT4通路的生物学重要性。

这些发现具有重要的机制和治疗意义。作者的数据进一步阐明了LKB1缺失LUAD肿瘤的免疫抑制表型，包括增加的M2极化和功能低下或衰竭的CD8⁺ T细胞。

作者的研究首次证明了增强的依赖MCT4的乳酸分泌是其中一些变化的介导因子，并且在MCT4转运蛋白或乳酸受体水平上靶向该通路可以消除M2极化，恢复某些方面的T细胞功能，并克服由LKB1缺失引起的PD-1抑制剂耐药性。值得注意的是，MCT4抑制剂或双重MCT1/4抑制剂在临床前模型中显示出有希望的抗肿瘤效果。然而，目前的报告存在一个局限性，即这些发现主要基于动物模型。还需要进一步的工作来确定在人类KRAS-LKB1突变的非小细胞肺癌中的临床相关性。作者的数据并不排除其他潜在机制，例如抑制STING表达78、增加GMDSCs79或细胞因子表达，可能对观察到的ICB耐药性有所贡献。然而，作者的发现确实提供了证据，表明靶向MCT4-乳酸通路可能增强抗肿瘤免疫和ICB响应，并且这种方法值得进一步研究以应对这一难治性人群的需求。