送你个对象

豆豆写于19.10.26-27

复杂的分析往往需要大量的数据，在R语言中，理解这些东西就需要~对象！
分析单细胞数据，常见的一个对象就是SingleCellExperiment或者sce，那么这次就来认识一下这个基础知识点

这是单细胞分析中的非常常用的S4对象，里面包罗万象，但依然有据可循。那么它是如何组织的？存储了什么内容？这就是我们这次要探索的任务。内容来自：https://osca.bioconductor.org/data-infrastructure.html

首先要上一张图

这个对象一定要不断反复查看

图中最核心的部分，是蓝色的data部分；另外还有绿色的基因注释信息feature metadata、橙色的细胞注释信息cell metadata。除了这三大件，还会包含一些下游分析结果，比如PCA、tSNE降维结果就会保存在紫色的Dimension Reductions

开始发挥想象力了哈！

如果把这个sce对象比作一艘货船，上面就会装载许多集装箱slots（理解为对象接口）  。每个箱子slot都是独立的，箱子里面包含的东西不一样，比如有的装食物，有的装砖头，各有各的特征。就sce来说，有的接口必须是数值型矩阵结构，有的就需要数据框结构。

核心部分-assays

创建一个sce对象很容易，只需要一个assays就可以，这是一个列表，其中包含了许多表达数据，例如原始数据count或者其他标准化处理过的数据，行是基因，列是样本

可以构建一个10个基因，3个细胞的矩阵【一定要是矩阵】

counts_matrix <- data.frame(cell_1 = rpois(10, 10), 
                    cell_2 = rpois(10, 10), 
                    cell_3 = rpois(10, 30))
rownames(counts_matrix) <- paste0("gene_", 1:10)

counts_matrix <- as.matrix(counts_matrix) 

有了这个，就可以用一个list构建出SingleCellExperiment对象。当然，这个list中可以包括任意个矩阵

sce <- SingleCellExperiment(assays = list(counts = counts_matrix))

>sce
## class: SingleCellExperiment 
## dim: 10 3 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(0):
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(0):
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):

为了得到这个对象中的矩阵，可以用两种方式获得：

• assay(sce, "counts")：这个方法是最通用的办法，而且其中的counts可以换成其他的名称，只要是出现在之前的list中都可以

• counts(sce)：它实现的东西和上面一样，只不过这个方法只适合提取counts这个名称的矩阵

counts(sce)
# 或者assay(sce, "counts")

##         cell_1 cell_2 cell_3
## gene_1       7      9     35
## gene_2       7      6     38
## gene_3      10     14     32
## gene_4       7      9     32
## gene_5      19     19     48
## gene_6       8      7     26
## gene_7      10     10     28
## gene_8       4     10     26
## gene_9      10      9     37
## gene_10      6     16     26

assays还能扩展

既然有了核心，那么就可以根据它进行多向拓展，这也是它强大的一个原因。

使用标准函数扩展

之前assays中只有原始表达矩阵，其实还能根据它扩展到归一化矩阵，例如使用一些R包的函数对包装的矩阵进行操作：

sce <- scran::computeSumFactors(sce)
sce <- scater::normalize(sce)

> sce
## class: SingleCellExperiment 
## dim: 10 3 
## metadata(1): log.exprs.offset
## assays(2): counts logcounts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(0):
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(0):
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):

这样，assays 就从一个存储原始矩阵的counts ，又扩增了归一化矩阵的logcounts 。同理，这个logcounts也是能有两种提取方法：

logcounts(sce)
# assay(sce, "logcounts")

##         cell_1 cell_2 cell_3
## gene_1    3.90   3.95   4.30
## gene_2    3.90   3.41   4.41
## gene_3    4.38   4.55   4.18
## gene_4    3.90   3.95   4.18
## gene_5    5.28   4.98   4.73
## gene_6    4.08   3.61   3.89
## gene_7    4.38   4.09   3.99
## gene_8    3.16   4.09   3.89
## gene_9    4.38   3.95   4.37
## gene_10   3.69   4.74   3.89

通过对比这个logcounts和counts数据，就能发现为什么要做normalization这一步：原始矩阵中1、2表达量差不多，但和3差别很大，很有可能是细胞3本身测序深度就比较高，因此得到的reads数也多；进行归一化以后，应该就去除了样本文库差异，结果看到1、2、3之间也变得可比了

到目前为止，我们总共得到了：

assays(sce)

## List of length 2
## names(2): counts logcounts

自定义扩展assays

这里的自定义指的是，我们不使用某个R包的某个函数，而是根据自己的想法，去根据原始矩阵得到一个新的矩阵

# 例如自己创建一个新的counts_100矩阵，然后依旧是通过这个名称进行访问
counts_100 <- assay(sce, "counts") + 100
assay(sce, "counts_100") <- counts_100 

看一下结果【注意：新增用的是assay单数，查看结果用的是assays复数】

assays(sce)
## List of length 3
## names(3): counts logcounts counts_100

小结

再回到第一张图，看看assays那里，是不是画了深蓝和浅蓝？这也是为了更好地表达：assays可以包含多个矩阵；构建sce对象可以一次一次加入新的矩阵，也可以用列表的形式，一次加入多个矩阵

列的注释信息：colData

之前有了”核心“——表达矩阵信息，那么其次重要的就是添加注释信息，这部分来介绍列的注释，针对的就是实验样本、细胞。这部分信息将会保存在colData中，它的主体是样本，于是将行名设定为样本，列名设为注释信息（如：批次、作者等等），对应上面图中的橙色部分。

接下来先设置一个细胞批次注释信息：

cell_metadata <- data.frame(batch = c(1, 1, 2))
rownames(cell_metadata) <- paste0("cell_", 1:3)

有了注释信息，怎么把它加入sce对象呢？

两种方法：一种是直接构建，一种是后续添加

• 直接构建：

  sce <- SingleCellExperiment(assays = list(counts = counts_matrix),
                           colData = cell_metadata)
  

• 后续添加

  colData(sce) <- DataFrame(cell_metadata)
  

然后看看sce对象添加了什么：

可以看到colData增加了之前设置的batch信息

sce
## class: SingleCellExperiment 
## dim: 10 3 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(0):
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(1): batch
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):

加入了sce对象以后，怎么获取它呢？

colData(sce)
## DataFrame with 3 rows and 1 column
##            batch
##        <numeric>
## cell_1         1
## cell_2         1
## cell_3         2

这个注释信息只能自己手动添加吗？

答案是no！有一些包可以自己计算，并且帮你添加进去。例如scater包的calculateQCMetrics()就会帮你计算几十项细胞的质量信息，结果依然是使用colData调用注释结果信息

sce <- scater::calculateQCMetrics(sce)
colData(sce)[, 1:5]
## DataFrame with 3 rows and 5 columns
##            batch is_cell_control total_features_by_counts
##        <numeric>       <logical>                <integer>
## cell_1         1           FALSE                       10
## cell_2         1           FALSE                       10
## cell_3         2           FALSE                       10
##        log10_total_features_by_counts total_counts
##                             <numeric>    <integer>
## cell_1               1.04139268515822           88
## cell_2               1.04139268515822          109
## cell_3               1.04139268515822          328

既然colData可以包含这么多的注释信息，那么怎么从中选取一部分呢？

例如想从colData中选择批次信息，和数据框取子集是类似的

sce$batch
# 或者colData(sce)$batch

## [1] 1 1 2

然后如果再想取批次中属于第一个批次的信息，就可以继续按照数据框的思路取子集：

sce[, sce$batch == 1]

## class: SingleCellExperiment 
## dim: 10 2 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(7): is_feature_control mean_counts ... total_counts
##   log10_total_counts
## colnames(2): cell_1 cell_2
## colData names(10): batch is_cell_control ...
##   pct_counts_in_top_200_features pct_counts_in_top_500_features
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):

这样看的colnames中就只剩两个细胞了

行的注释信息：rowData/rowRanges

既然样本有注释信息，那么同样的，基因也有自己的注释，它就存放在rowData或者rowRanges中，这两个的区别就是：

• rowData：是一个数据框的结构，它就存储了核心assays矩阵的基因相关信息

  它返回的结果就是这样：

  rowData(sce)[, 1:3]
  
  ## DataFrame with 10 rows and 3 columns
  ##         is_feature_control      mean_counts log10_mean_counts
  ##                  <logical>        <numeric>         <numeric>
  ## gene_1               FALSE               17  1.25527250510331
  ## gene_2               FALSE               17  1.25527250510331
  ## gene_3               FALSE 18.6666666666667  1.29373075692248
  ## gene_4               FALSE               16  1.23044892137827
  ## gene_5               FALSE 28.6666666666667  1.47226875192525
  ## gene_6               FALSE 13.6666666666667  1.16633142176653
  ## gene_7               FALSE               16  1.23044892137827
  ## gene_8               FALSE 13.3333333333333  1.15634720085992
  ## gene_9               FALSE 18.6666666666667  1.29373075692248
  ## gene_10              FALSE               16  1.23044892137827
  

• rowRanges：也是基因相关，但是它是GRange对象，存储了基因坐标信息，例如染色体信息、起始终点坐标

  它返回的结果就是这样：

  rowRanges(sce) 
  ## GRangesList object of length 10:
  ## $gene_1
  ## GRanges object with 0 ranges and 0 metadata columns:
  ##    seqnames    ranges strand
  ##       <Rle> <IRanges>  <Rle>
  ##   -------
  ##   seqinfo: no sequences
  ## 
  

怎么按行取子集？

同样类似于数据框，可以按位置、名称取子集：

sce[c("gene_1", "gene_4"), ]
# 或者 sce[c(1, 4), ] 

## class: SingleCellExperiment 
## dim: 2 3 
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(2): gene_1 gene_4
## rowData names(7): is_feature_control mean_counts ... total_counts
##   log10_total_counts
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(10): batch is_cell_control ...
##   pct_counts_in_top_200_features pct_counts_in_top_500_features
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):

看到rownames结果就剩2个基因

除了以上3大块，还有一些重要的”集装箱“需要介绍，这些前面用附标识

附1：对样本进行归一化：“sizeFactors“

这里面装了根据样本文库计算的文库大小因子，是一个数值型向量，用于后面的归一化

sce <- scran::computeSumFactors(sce)
sce <- scater::normalize(sce)
sizeFactors(sce)
## [1] 0.503 0.623 1.874

前面提到的：assays (primary data), colData (sample metadata), rowData/rowRanges (feature metadata), and sizeFactors 。其实这其中前三个都来自于SummarizedExperiment这个对象。基于这个对象，还建立了一些新的对象接口，例如下面👇的：

附2：降维结果：reducedDims

存储了原始矩阵的降维结果，可以通过PCA、tSNE、UMAP等得到，它是一个数值型矩阵的list，行名是原来矩阵的列名（就是细胞、样本），它的列就是各种维度信息

它和assays一样，也可以包含许多降维的结果，例如用scater包计算PCA：

sce <- scater::runPCA(sce)
# 这个算法是利用了sce对象的归一化结果logcounts(sce)
reducedDim(sce, "PCA")
##           PC1    PC2
## cell_1 -0.639 -0.553
## cell_2  0.982 -0.123
## cell_3 -0.343  0.677
## attr(,"percentVar")
## [1] 65.7 34.3

除了PCA，tSNE的结果也是存储在这里：

sce <- scater::runTSNE(sce, perplexity = 0.1)
reducedDim(sce, "TSNE")
##         [,1]  [,2]
## cell_1 -5664  -542
## cell_2  3306 -4642
## cell_3  2359  5184

看下全部的结果都包含什么：

reducedDims(sce)
## List of length 2
## names(2): PCA TSNE

调取方法也十分类似assay，数据矩阵存储在assays，而调用是assay；这里的降维结果存储在reducedDims，调用是reducedDim

这个降维信息只能自己手动添加吗？

答案也是no！和前面的counts_100加到assays的思路一样，我们也可以自己计算，而不用现成的函数，最后加到reducedDims这个接口。

例如，进行UMAP降维，虽然可以用scater::runUMAP()，但依然可以自己处理。

比如这里使用uwot包，不过这个包只能计算，不能添加到sce对象，需要手动添加：

u <- uwot::umap(t(logcounts(sce)), n_neighbors = 2)
reducedDim(sce, "UMAP_uwot") <- u

reducedDim(sce, "UMAP_uwot")
#          [,1]   [,2]
## cell_1  0.453 -0.464
## cell_2 -0.115  0.633
## cell_3 -0.339 -0.169
## attr(,"scaled:center")
## [1]  8.69 -2.22

最后再来看一下：

reducedDims(sce)
## List of length 3
## names(3): PCA TSNE UMAP_uwot

附3：metadata 接口

虽然前面介绍了许多接口，但还是有很多DIY的，不能直接导入它们，不过我们仍然需要这些信息，于是medata接口诞生。它可以存储任意类型的数据，只要给它一个名字。

例如，我们有几个感兴趣的基因（比如是高变化基因），现在想要把它保存在sce中，方便以后使用：

my_genes <- c("gene_1", "gene_5")
metadata(sce) <- list(favorite_genes = my_genes)

metadata(sce)
## $favorite_genes
## [1] "gene_1" "gene_5"s

既然是一个列表，就意味着支持扩展：

your_genes <- c("gene_4", "gene_8")
metadata(sce)$your_genes <- your_genes

metadata(sce)
## $favorite_genes
## [1] "gene_1" "gene_5"
## 
## $your_genes
## [1] "gene_4" "gene_8"

附4：spike-in信息

使用isSpike来添加：

isSpike(sce, "ERCC") <- grepl("^ERCC-", rownames(sce))

# 结果就会在sce中添加：
## spikeNames(1): ERCC

spikeNames(sce)
## [1] "ERCC"

table(isSpike(sce, "ERCC"))
# 就能看存在多少Spike-in