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提取代表转录本之 gencode

Introduction

一个基因存在一个或多个转录本（variants），后续我们想研究某个基因的话，那么如何选取哪个转录本进行研究？比如引物设计等，或者绘图。为了减少工作量可以选取基因的代表性的转录本（Representative transcript）进行研究，那么如何选取合适或合理的 代表转录本 呢？

1、选转录本最长的
2、选表达量最高的
3、选外显子数量最多的

貌似第一种选取最长的转录本作为研究是最多的，很多文献里也使用过，至于合不合理都有一定的缺点，也许发挥主要功能的不一定是最长的那个转录本，也可能不同转录本发挥着不一样的功能，但应该都是少数情况，大部分最长的转录本发挥主要功能。

成熟的 mRNA 要想发挥功能主要依赖于 CDS 区翻译出来的蛋白，成熟的蛋白是一切功能的承载者，基于此，选取代表转录本可以基于两个选择：

a、选取 CDS 区最长的
b、其次再选取最长的转录本

我们从 gencode 数据库下载 human 的注释文件，从里面提取 Representative transcript 再导出筛选出代表转录本的 gtf 文件。

开始分析

下载注释文件：

# wget 下载
$ wget http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_38/gencode.v38.annotation.gtf.gz
# 解压
$ gunzip gencode.v38.annotation.gtf.gz
# 查看一下内容
$ less -S gencode.v38.annotation_human.gtf| head -10
##description: evidence-based annotation of the human genome (GRCh38), version 38 (Ensembl 104)
##provider: GENCODE
##contact: gencode-help@ebi.ac.uk
##format: gtf
##date: 2021-03-12
chr1    HAVANA  gene    11869   14409   .       +       .       gene_id "ENSG00000223972.5"; gene_type "transcribed_unprocessed_pseudogene"; gene_name "DDX11L1"; level 2; hgnc_id "HGNC:37102"; havana_gene "OTTHUMG00000000961.2";
chr1    HAVANA  transcript      11869   14409   .       +       .       gene_id "ENSG00000223972.5"; transcript_id "ENST00000456328.2"; gene_type "transcribed_unprocessed_pseudogene"; gene_name "DDX11L1"; transcript_type "processed_transcript"; transcript_name "DDX11L1-202"; level 2; transcript_support_level "1"; hgnc_id "HGNC:37102"; tag "basic"; havana_gene "OTTHUMG00000000961.2"; havana_transcript "OTTHUMT00000362751.1";
chr1    HAVANA  exon    11869   12227   .       +       .       gene_id "ENSG00000223972.5"; transcript_id "ENST00000456328.2"; gene_type "transcribed_unprocessed_pseudogene"; gene_name "DDX11L1"; transcript_type "processed_transcript"; transcript_name "DDX11L1-202"; exon_number 1; exon_id "ENSE00002234944.1"; level 2; transcript_support_level "1"; hgnc_id "HGNC:37102"; tag "basic"; havana_gene "OTTHUMG00000000961.2"; havana_transcript "OTTHUMT00000362751.1";
chr1    HAVANA  exon    12613   12721   .       +       .       gene_id "ENSG00000223972.5"; transcript_id "ENST00000456328.2"; gene_type "transcribed_unprocessed_pseudogene"; gene_name "DDX11L1"; transcript_type "processed_transcript"; transcript_name "DDX11L1-202"; exon_number 2; exon_id "ENSE00003582793.1"; level 2; transcript_support_level "1"; hgnc_id "HGNC:37102"; tag "basic"; havana_gene "OTTHUMG00000000961.2"; havana_transcript "OTTHUMT00000362751.1";
chr1    HAVANA  exon    13221   14409   .       +       .       gene_id "ENSG00000223972.5"; transcript_id "ENST00000456328.2"; gene_type "transcribed_unprocessed_pseudogene"; gene_name "DDX11L1"; transcript_type "processed_transcript"; transcript_name "DDX11L1-202"; exon_number 3; exon_id "ENSE00002312635.1"; level 2; transcript_support_level "1"; hgnc_id "HGNC:37102"; tag "basic"; havana_gene "OTTHUMG00000000961.2"; havana_transcript "OTTHUMT00000362751.1";

导入 gtf 文件

# 安装加载R包，读取gtf文件
BiocManager::install('rtracklayer')
library(tidyverse)
library(rtracklayer)

# 设置工作路径
setwd('C:UsersadminDesktoptest')
# 读取gtf文件
gtf <- import('gencode.v38.annotation_human.gtf')
# 转为data.frame
my_gtf <- data.frame(gtf)

筛选

我们选取蛋白编码基因（protein coding）和 CCDS 共识基因（member of the consensus CDS gene set, confirming coding regions between ENSEMBL, UCSC, NCBI and HAVANA）。

# 筛选
pt_gtf <- my_gtf %>% filter(gene_type == 'protein_coding',tag == 'CCDS')
# 检查基因数量
gene_name <- unique(pt_gtf$gene_name)
length(gene_name)
[1] 18808
# 筛选出18808个基因

分析思路

因为我们有 18808 个基因需要循环走一遍，需要较长时间，所以在测试是可以取小样本测试，比如取 100 或 200 个基因测试即可。

提取代表性转录本

下面是循环体代码：

# 建一个储存结果信息的list
longest_gtf <- list()

# 筛选
# 测试100个基因
gene_na <- gene_name[1:100]

for (g in gene_na){

  # 挑选基因
  ginfo <- pt_gtf %>% filter(gene_name == g)
  # 提取转录本
  tinfo <- ginfo %>% filter(type == 'transcript')
  # 提取转录本数量
  ntspt <- nrow(tinfo)
  # 如果只有一个转录本
  if(ntspt == 1){
    # 提取只有一个转录本的转录本名
    one_tname <- tinfo$transcript_name
    # 提取基因和转录本信息
    gene_line <- my_gtf %>% filter(gene_name == g,type == 'gene')
    one_tspt <- my_gtf %>% filter(gene_name == g,transcript_name == one_tname)

    # 合并gene和转录本信息
    last_res <- rbind(gene_line,one_tspt)
    # 保存结果到list中
    longest_gtf[[g]] <- last_res
  }else{
    # 如果有多个转录本
    # 提取转录本名字
    tspt_name <- tinfo$transcript_name
    # 循环每个转录本
    # 储存转录本cds长度的list
    cds_length_all <- list()
    # 循环
    for(tname in tspt_name){
      mtinfo <- ginfo %>% filter(transcript_name == tname,type == 'CDS')
      # 计算cds区总长度
      cds_len <- sum(mtinfo$width)
      # 储存在list中
      cds_length_all[[tname]] <- cds_len
    }
      # 转化类型为向量
      a <- unlist(cds_length_all)
      # 查看是否有cds长度相等的转录本
      equal_cds <- duplicated(a)

      # 循环
      if("TRUE" %in% equal_cds){
        # 如果有相同cds长度相等的转录本就取转录本最长的
        # 获取最大cds长度
        max_num <- max(a)
        # 提取最大最大cds长度对应的转录本名称
        tn <- data.frame(a)
        tspt_name <- rownames(tn %>% filter(a == max_num))
        # 提取tinfo信息
        tspt_longest_info <- tinfo[which(tinfo$transcript_name %in% tspt_name),]
        # 按转录本长度降序排列，取第一个最长的转录本名称
        tspt_longest_info <- tspt_longest_info[order(tspt_longest_info$width,decreasing = T),]
        tx_cdsequal_longest_name <- tspt_longest_info$transcript_name[1]
        # 提取gtf信息储存
        gene_line <- my_gtf %>% filter(gene_name == g,type == 'gene')
        cds_txlongest <- my_gtf %>% filter(gene_name == g,transcript_name == tx_cdsequal_longest_name)

        # 合并gene和转录本信息
        last_res <- rbind(gene_line,cds_txlongest)
        # 保存结果到list中
        longest_gtf[[g]] <- last_res

      }else{
        # 如果没有相同cds长度相等的转录本就取cds最长的
        # 获取最大cds长度
        max_num <- max(a)
        # 提取最大最大cds长度对应的转录本名称
        tn <- data.frame(a)
        tspt_name <- rownames(tn %>% filter(a == max_num))
        # 提取gtf信息储存
        gene_line <- my_gtf %>% filter(gene_name == g,type == 'gene')
        cds_longest <- my_gtf %>% filter(gene_name == g,transcript_name == tspt_name)

        # 合并gene和转录本信息
        last_res <- rbind(gene_line,cds_longest)
        # 保存结果到list中
        longest_gtf[[g]] <- last_res
    }
  }
}

运行结束后，整理查看结果：

# 把结果文件longest_gtf转为data.frame
my_longest_gtf <- do.call('rbind',longest_gtf)

# 查看基因数量
length(table(my_longest_gtf$gene_name))
[1] 100
# 查转录本数量
length(table(my_longest_gtf$transcript_id))
[1] 100
# 导出 gtf 结果
export(my_longest_gtf,'my_longest_transcript.gtf',format = 'gtf')

简单验证：

验证 1： 基因有多个转录本，CDS 区只有一个最大值的转录本：

# 挑选基因
ginfo <- pt_gtf %>% filter(gene_name == 'NANOG')
# 提取转录本
tinfo <- ginfo %>% filter(type == 'transcript')
# 提取转录本数量
ntspt <- nrow(tinfo)
ntspt
[1] 2
# 转录本名称，有两个转录本
tname <- tinfo$transcript_name
tname
[1] "NANOG-201" "NANOG-202"
# 提取CDS
mtinfo <- ginfo %>% filter(transcript_name == tname[1],type == 'CDS')
# 计算cds区总长度，第一个转录本 NANOG-201
cds_len <- sum(mtinfo$width)
[1] 915
mtinfo <- ginfo %>% filter(transcript_name == tname[2],type == 'CDS')
# 计算cds区总长度，第二个转录本 NANOG-202
cds_len <- sum(mtinfo$width)
[1] 867

我们可以看到 NANOG 这个基因有两个转录本NANOG-201、NANOG-202，第一个转录本的 CDS 区比第二个长，我们直接把 NANOG 放到循环里跑一下，只需要把 gene_na 替换成 NANOG 即可，后面代码都是一样：

# 建一个储存结果信息的list
longest_gtf <- list()

# 筛选
# 测试 NANOG 个基因

for (g in 'NANOG'){
...

查看筛选的结果：

unique(my_longest_gtf$transcript_name)
[1] NA          "NANOG-201"

验证 2： 基因有多个转录本，CDS 区有多个最大值的转录本：

# 挑选基因
ginfo <- pt_gtf %>% filter(gene_name == 'SMIM1')
# 提取转录本
tinfo <- ginfo %>% filter(type == 'transcript')
# 提取转录本数量
ntspt <- nrow(tinfo)
ntspt
[1] 2
# 转录本名称，有两个转录本
tname <- tinfo$transcript_name
tname
[1] "SMIM1-204" "SMIM1-201"
# 提取CDS
mtinfo <- ginfo %>% filter(transcript_name == tname[1],type == 'CDS')
# 计算cds区总长度，第一个转录本 SMIM1-204
cds_len <- sum(mtinfo$width)
[1] 234
mtinfo <- ginfo %>% filter(transcript_name == tname[2],type == 'CDS')
# 计算cds区总长度，第二个转录本 SMIM1-201
cds_len <- sum(mtinfo$width)
[1] 234

# 查看转录本长度
tinfo %>% filter(transcript_name ==  tname[1]) %>% select(width)
  width
1  3208
tinfo %>% filter(transcript_name ==  tname[2]) %>% select(width)
  width
1  3196

可以看到 SMIM1 基因有两个转录本 SMIM1-204、SMIM1-201，CDS 长度都一样，转录本长度则是都一个长以一点，我们跑一下循环试试：

# 建一个储存结果信息的list
longest_gtf <- list()

# 筛选
# 测试 NANOG 个基因

for (g in 'SMIM1'){
...

查看筛选的结果：

unique(my_longest_gtf$transcript_name)
[1] NA          "SMIM1-204"

可以看到在 CDS 长度相等的情况下选取了转录本最长的那个。

对转录本 id 修改格式

transcript_id 格式类似于这样 ENST00000642557.4，ensembl 数据库的是没有小数点的，gencode 数据库有，UCSC 数据库的 NM_001385803.1 等类型的，gffread 软件可以提取注释文件转录本序列，将 exon、UTR 等序列合并成完整的 cDNA 序列，输出的序列的名字就是 transcript id，可以在 transcript_id 上多增加一些信息便于后面的筛选或数据分析。

目标

把每个基因转录本的基因名、gene id、transcript id、起始密码子位置、终止密码子位置、转录本长度以下划线连接替换为原来的 transcript_id。

类似于这样： gene_namegene_idtranscript_idstart_codonstop_codon__transcript_length

分析

本以为比较简单，只要取出每个基因，然后提取出对应的位置信息直接 paste 粘贴在一起，然后重新赋值给 transcript_id 就行了，但后来居然报错了，于是查看了 start codon 和 stop codon 的数量，发现居然比基因或者转录本的数量要多！也就是说一个转录本有多个起始密码子或者终止密码子，所以赋值的时候长度不一样会报错。

注释文件记录的是基因组上的位置！

Start Codon：

画个示意图说明：

从上图我们可以看到，起始密码子中如果没有剪切位点时，记录的位置是连续的，只有一个注释。如果存在剪切位点，记录的位置就不是连续的，会有两个个注释位点的信息。比如像 VAMP3 基因：

VAMP3 基因的起始密码子被截断成了 AT 和第下一个外显子上的第一个碱基 G，中间是内含子部分，所以注释文件会有连个注释信息。这种属于示意图第二个小图里的情况。

Stop Codon：

画个示意图说明：

和 start codon 的情况一样，可以看到，终止密码子中如果没有剪切位点时，记录的位置是连续的，只有一个注释。如果存在剪切位点，记录的位置就不是连续的，会有两个个注释位点的信息。比如像 RPAP2 基因：

RPAP2 基因的终止密码子被截断成了 TG 和下一个外显子的 A，中间是内含子部分。这种属于示意图第三个小图里的情况。

有没有可能有以上这种情况，start 或 stop codon 被两个内含子分开，形成了三个位点，会不会在注释文件里一个转录本有三个 start codon 或 stop codon 信息？这就关系到我上一篇文章里提到的问题了。最短的外显子有一个碱基？

我们可以写个循环判断一下有没有 3 个 start 或 stop codon 注释信息。

思路：

提取每个基因的转录本，循环每个转录本的信息，判断有 1 个、2 个或 3 个 start/stop codon 的数量，符合条件的转录本名字被分别储存在对应的向量里，这样我们就获得了不同起始密码子和终止密码子数量的转录本的数量。

# @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@

# 判断转录本有几个start codon 或 stop codon
gene_name <- unique(pt_gtf$gene_name)
length(gene_name)
[1] 18808

# 查看转录本数量
length(unique(pt_gtf$transcript_name))
[1] 43479

# 创建储存含有1、2、3个start codon 和 stop codon的向量
# 此外创建没有start codon 或 stop codon的向量
t_st1 <- c()
t_st2 <- c()
t_st3 <- c()
no_detected_st <- c()

t_sp1 <- c()
t_sp2 <- c()
t_sp3 <- c()
no_detected_sp <- c()