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      • 单细胞多样本整合之harmony

      单细胞多样本整合之harmony

      • 发布者 jiangxingyu
      • 分类 未分类
      • 日期 2022年7月12日
      测试开头
      单细胞多样本整合之harmony单细胞多样本整合之harmony 今天是生信星球陪你的第877天单细胞多样本整合之harmony

         大神一句话,菜鸟跑半年。我不是大神,但我可以缩短你走弯路的半年~

         就像歌儿唱的那样,如果你不知道该往哪儿走,就留在这学点生信好不好~

         这里有豆豆和花花的学习历程,从新手到进阶,生信路上有你有我!

      和上一篇是同一个数据集,单细胞多样本整合分析,换一种整合的方法。

      1.下载和读取数据

      rm(list = ls())
      library(stringr)
      library(Seurat)
      library(dplyr)
      f = dir("GSE117570_RAW/");f
      ## [1] "GSM3304007_P1_Tumor_processed_data.txt.gz"
      ## [2] "GSM3304011_P3_Tumor_processed_data.txt.gz"
      ## [3] "GSM3304013_P4_Tumor_processed_data.txt.gz"
      s = str_split(f,"_",simplify = T)[,1];s
      ## [1] "GSM3304007" "GSM3304011" "GSM3304013"
      scelist = list()
      for(i in 1:length(f)){
        tmp = read.table(paste0("GSE117570_RAW/",f[[i]]),
                       check.names = F)
        tmp = as.matrix(tmp)

        scelist[[i]] <- CreateSeuratObject(counts = tmp, 
                                 project = s[[i]], 
                                 min.cells = 3, 
                                 min.features = 50)
        scelist[[i]][["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(scelist[[i]], pattern = "^MT-")
        scelist[[i]] <- subset(scelist[[i]], subset = percent.mt < 5)
      }
      names(scelist)  = s
      lapply(scelist, function(x)dim(x@assays$RNA@counts))
      ## $GSM3304007
      ## [1] 6611 1466
      ## 
      ## $GSM3304011
      ## [1] 3211  116
      ## 
      ## $GSM3304013
      ## [1] 7492  281

      2.合并到一起,找高变基因

      sce.all <- merge(scelist[[1]],
                       y= scelist[ -1 ] ,
                       add.cell.ids =  s) 

      # 查看数据
      head(sce.all@meta.data, 10)
      ##                               orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt
      ## GSM3304007_AAACCTGGTACAGACG-1 GSM3304007       4338         1224   2.512679
      ## GSM3304007_AAACGGGGTAGCGCTC-1 GSM3304007      11724         2456   2.021494
      ## GSM3304007_AAACGGGGTCCTCTTG-1 GSM3304007       3353          726   2.117507
      ## GSM3304007_AAACGGGTCCAAACAC-1 GSM3304007       2811          986   2.312344
      ## GSM3304007_AAACGGGTCTTTAGTC-1 GSM3304007       6095         1590   3.002461
      ## GSM3304007_AAAGATGCATCTACGA-1 GSM3304007       7683         2049   2.824418
      ## GSM3304007_AAAGATGCATTGAGCT-1 GSM3304007       2428          832   2.800659
      ## GSM3304007_AAAGATGGTTCAGTAC-1 GSM3304007       2939         1052   3.028241
      ## GSM3304007_AAAGATGTCTGGTATG-1 GSM3304007       6834         1452   3.906936
      ## GSM3304007_AAAGCAAAGACTACAA-1 GSM3304007       3429          737   2.391368
      table(sce.all@meta.data$orig.ident) 
      ## 
      ## GSM3304007 GSM3304011 GSM3304013 
      ##       1466        116        281
      VlnPlot(sce.all, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
      单细胞多样本整合之harmony
      FeatureScatter(sce.all, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
      单细胞多样本整合之harmony
      sce.all <- NormalizeData(sce.all)
      sce.all <- FindVariableFeatures(sce.all)

      # Identify the 10 most highly variable genes
      top10 <- head(VariableFeatures(sce.all), 10)

      # plot variable features with and without labels
      plot1 <- VariableFeaturePlot(sce.all)
      plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
      plot2
      单细胞多样本整合之harmony

      3. PCA

      完成PCA线性降维,是后续其他降维方法的基础

      sce.all <- ScaleData(sce.all)
      sce.all[["RNA"]]@counts[1:4,1:4]## 4 x 4 sparse Matrix of class "dgCMatrix"
      ##            GSM3304007_AAACCTGGTACAGACG-1 GSM3304007_AAACGGGGTAGCGCTC-1
      ## FO538757.2                             .                             .
      ## AP006222.2                             .                             .
      ## NOC2L                                  .                             .
      ## ISG15                                 11                             3
      ##            GSM3304007_AAACGGGGTCCTCTTG-1 GSM3304007_AAACGGGTCCAAACAC-1
      ## FO538757.2                             .                             .
      ## AP006222.2                             .                             .
      ## NOC2L                                  .                             .
      ## ISG15                                  .                             4
      sce.all <- RunPCA(sce.all, features = VariableFeatures(sce.all))
      DimPlot(sce.all, reduction = "pca")
      单细胞多样本整合之harmony
      # 应该选多少个主成分进行后续分析
      ElbowPlot(sce.all)
      单细胞多样本整合之harmony
      sce.all <- JackStraw(sce.all, num.replicate = 100)
      sce.all <- ScoreJackStraw(sce.all, dims = 1:20)
      JackStrawPlot(sce.all, dims = 1:20)
      单细胞多样本整合之harmony

      4.harmony和UMAP

      harmony用于整合数据时消除样本间的差异,上一篇是用Seurat自带的CCA方法整合。

      library(harmony)
      sce.all <- RunHarmony(sce.all, "orig.ident")
      names(sce.all@reductions)
      ## [1] "pca"     "harmony"
      sce.all <- RunUMAP(sce.all,  dims = 1:15, 
                           reduction = "harmony")
      DimPlot(sce.all,reduction = "umap",label=T ) 
      单细胞多样本整合之harmony
      sce.all <- FindNeighbors(sce.all,reduction = "harmony",dims = 1:15)
      sce.all <- FindClusters(sce.all, resolution = 0.2) #分辨率
      ## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
      ## 
      ## Number of nodes: 1863
      ## Number of edges: 64311
      ## 
      ## Running Louvain algorithm...
      ## Maximum modularity in 10 random starts: 0.9515
      ## Number of communities: 9
      ## Elapsed time: 0 seconds
      # 结果聚成几类,用Idents查看
      length(levels(Idents(sce.all)))
      ## [1] 9
      table(sce.all@active.ident) 
      ## 
      ##   0   1   2   3   4   5   6   7   8 
      ## 667 382 246 172 127 101  81  57  30
      DimPlot(sce.all,reduction = "umap",label=T ) 
      单细胞多样本整合之harmony

      5.SingleR注释

      # 注释
      library(celldex)
      library(SingleR)
      #ref <- celldex::HumanPrimaryCellAtlasData()
      #因为下载太慢,使用了提前存好的本地数据
      ref <- get(load("../single_ref/ref_Hematopoietic.RData"))
      library(BiocParallel)
      pred.scRNA <- SingleR(test = sce.all@assays$RNA@data, 
                            ref = ref,
                            labels = ref$label.main, 
                            clusters = sce.all@active.ident)
      pred.scRNA$pruned.labels
      ## [1] "Monocytes"       "CD4+ T cells"    "Erythroid cells" "B cells"        
      ## [5] "Monocytes"       "CD4+ T cells"    "CD8+ T cells"    "HSCs"           
      ## [9] "HSCs"
      plotScoreHeatmap(pred.scRNA, clusters=pred.scRNA@rownames, fontsize.row = 9,show_colnames = T)
      单细胞多样本整合之harmony
      new.cluster.ids <- pred.scRNA$pruned.labels
      names(new.cluster.ids) <- levels(sce.all)
      levels(sce.all)
      ## [1] "0" "1" "2" "3" "4" "5" "6" "7" "8"
      sce.all <- RenameIdents(sce.all,new.cluster.ids)
      levels(sce.all)
      ## [1] "Monocytes"       "CD4+ T cells"    "Erythroid cells" "B cells"        
      ## [5] "CD8+ T cells"    "HSCs"
      UMAPPlot(object = sce.all, pt.size = 0.5, label = TRUE)
      单细胞多样本整合之harmony
      如果因为代码看不懂,而跟不上正文的节奏,可以来找我,系统学习。以下课程都是循环开课。下一期的时间,点进去咨询微信咯
      生信零基础入门学习小组
      生信入门班(四周线上直播课)
      数据挖掘班(医生/医学生首选)
      测试结尾

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