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      • 新的 m6A 识别蛋白 MOV10

      新的 m6A 识别蛋白 MOV10

      • 发布者 weinfoadmin
      • 分类 老俊俊的生信笔记
      • 日期 2021年9月10日
      • 评论 0评论

      感谢老俊俊的大力支持。我们会每日跟新,欢迎您关注老俊俊的生信笔记。

      分享一篇 m6A 文献,目前还在预印本上面,还没发表。

      文章标题:

      筛选出一个新的 m6A 识别蛋白 MOV10,能够以 m6A 依赖的方式 降解 含有 m6A 修饰的 mRNA 来 维持小鼠胚胎干细胞的状态 。

      接下来从背景、结果、讨论等方便进行介绍。

      1、背景

      m6A 在真核生物里 mRNA 和 lncRNA 上都有广泛的修饰,并且是一个动态变化的过程。m6A 修饰参与了 RNA 的转运、剪接、稳定、降解、翻译等多种生物学过程。

      高通量测序结果发现 m6A 修饰主要位于 stop codon 和 3'UTR 位置附近,存在一个保守的 R(A/G)R(A/G)ACH(A/C/U)的基序。

      m6A 修饰主要被甲基化酶转运复合体 METTL3、METTL14 和相关的亚单元 WTAP、KIAA1429 和 ZC3H13 甲基化,被去甲基化酶 FTO 和 ALKBH5 进行去甲基化。此外还可以被 m6A 的识别蛋白(m6A readers) 结合发挥不同的生物学功能,例如 YTHDF(YTHDF1-3)家族,YTHDC(YTHDC1-2)家族、IGF2BP(IGF2BP1-3)家族,HNRNP 家族,在翻译、RNA 稳定性、降解、剪接等方面发挥作用。

      目前大部分研究都主要集中在已知的 m6A 蛋白身上,作者为了研究 m6A 修饰在小鼠胚胎干细胞中的作用寻找到了新的 m6A 识别蛋白,并研究了起机制。

      2、结果部分

      如何发现新的识别蛋白?

      作者采用了 RNA-pulldown 实验结合蛋白质谱技术,通过含有 3 个 m6A 修饰 的基序重复序列的 单链 RNA 探针 拉到了很多 m6A 识别蛋白。其中拿没有 m6A 修饰的探针作为对照实验。

      对结果进行分析发现很多经典的识别蛋白也被成功捕获,同时发现了一个新的识别蛋白 MOV10 ,WB 结果看到这些识别蛋白更会优先结合 m6A 修饰的 RNA。

      MOV10 结合的哪些 RNA?

      作者为了探究 MOV10 结合了哪些 RNA,对 MOV10 做了 RIP-seq,同时在 mESC 中做了 m6A-seq,分别鉴定到 5808 和 4953 个 peak,可以看到 MOV10 结合的位置主要是 CDS 和 3'UTR 区:

      RIP-seq 和 m6A-seq 的 overlap 有 2155 个重合的 peaks:

      可以认为这些是 MOV10 结合 m6A 修饰的靶标,作者称为:MOV10+m6A targets 。那些含有不含有 m6A 修饰但被结合的称为:MOV10-m6A targets。

      MOV10 结合靶标和 m6A-seq 结果类似

      作者针对 2155 peaks 与 m6A-seq 结果比较分析,发现两种在 整体结合 pattern 还是 单个基因上的模式 相似:

      作者还比较了2155 peaks 和非 7764 个 MOV10 结合的序列的富集 motif 基序,发现只有 MOV10 结合的 m6A 修饰的序列表现出 GGACU motif 的富集:

      小结:

      通过以上实验验证发现 MOV10 是一个 m6A 结合蛋白,能选择性的结合含有 m6A 修饰的 RNA。


      MOV10 的生物学功能?

      MOV10-KO 细胞系构建

      为了进一步探索 MOV10 在 mESC 中的功能,作者构建了crispr MOV10 基因的敲除 mESC 细胞系,WB 和免疫荧光验证 MOV10 基因敲除的很干净 :

      MOV10-KO m6A-seq

      随后作者比较了 MOV10 基因 在 KO 条件下的 MOV10 结合的 m6A 修饰的靶标基因的 m6A 水平变化,通过 KO 以后的 m6A-seq 数据分析,发现相比较非 MOV10 靶标基因而言,在 MOV10 基因敲除后,MOV10 结合 m6A 修饰的靶标(2155)的 m6A 水平发生了显著下降:

      作者还对 MOV10 所有结合的 peaks 在 MOV10 KO 以后检查了 m6A 水平变化,发现并没有多大变化,暗示 MOV10 只调控其结合 m6A 修饰的靶标基因:

      MOV10-KO 的 RNA-seq 也显示只有 2155 那些靶标才有显著性变化:

      MOV10 是否在转录后调控其靶 mRNA?

      为了进一步研究 MOV10 在哪一过程调控其靶标发挥作用,作者做了 半衰期实验 和 翻译效率实验 。

      发现在 MOV10 KO 以后,MOV10+m6A targets 的 半衰期显著增加 ,而其它两种并没有变化:

      在 MOV10 KO 以后,MOV10+m6A targets,MOV10-m6A targets,MOV10 non-targets 翻译效率并没有变化:

      Ribo-seq 质控图(片段分布、样本相关性、frame 分布、火山图):

      小结:

      综合以上结果分析,MOV10 以 m6A 依赖的方式去降解或使其 mRNA 结合靶标不稳定。


      MOV10 驱动降解的具体分子机制和结合靶标?

      为了剖析 MOV10 结合靶点驱动降解过程的潜在分子功能,作者做了 MOV10 的 co-IP 实验,结合定量质谱检测,发现了一些与 MOV10 互相作用高置信度的互作蛋白。

      GO 和 CC 富集分析发现这些富集到 mRNA 的加工、可变剪接、翻译、转运、稳定性和核糖核蛋白复合物、Pbody、多聚腺苷酸化特异性因子(CPSFs)复合物、剪接复合物等通路里:

      实验验证也确实能看到 MOV10 定位在细胞质和细胞核里,其中包括 Pbody:

      互作蛋白里主要包括:Pbody 蛋白、剪接因子、HNRNP 蛋白、RNA 结合蛋白等:

      CPSFs, PABPC1, TUT4 与 mRNA 3’端加工,plolyA 长度有关, CPSFs, HNRNPs和剪接因子与剪接有关,这些都与 MOV10 互相作用,作者检测了 ployA 长度和 m6A 基序富集的剪接情况,发现都没有差异,并不能与 MOV10 驱动降解联系起来:

      然后作者猜测可能是通过无义介导的mRNA降解机制( nonsense-mediated mRNA decay (NMD))来介导的,因为 MOV10 与 UPF1 蛋白有很强的互作性。

      无义介导的 mRNA 降解机制:

      无义介导的 mRNA 降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作为真核细胞中重要 RNA 监控机制,识别并降解开放阅读框中含有提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的 mRNA,以避免因截短的蛋白产物积累对细胞造成毒害. NMD 还调控正常生理基因的表达,暗示其在真核细胞中扮演重要角色. NMD 途径的关键是 PTC 的识别。NMD 通常由 NMD 因子 UPF1(up-frameshift)等被招募至含 PTC 的 mRNA 上,借助这些因子组装形成“功能复合体”并激活降解.但对于 PTC 识别后的过程仍认识有限。

      MOV10 维持 Pbody 的完整性

      MOV10 与很多的 pbody 蛋白互相作用,作者探究 MOV10 是否与 Pbody 的完整性有关。

      EDC4 是 Pbody 的标记,免疫荧光显示 MOV10 和 EDC4 有很大一部分(93%)的 共定位和 点状结构 :

      然而在 NOV10 KO 后,点状结构显著减少。

      小结

      以上实验表面 MOV10 在 mESC 中维持 P body 的完整性。


      结合 MOV10 促进降解和维持 Pbody 的完整性结果,作者推测 MOV10 只降解在 P body 中含有 m6A 修饰地 mRNA。

      为了验证假设,作者做了 DDX6 的 RIP-seq(Pbody 的重要组成成分),发现与 MOV10 的 RIP-seq 结合 靶标大部分重叠 ,此外它们也有 高度的共定位现象 :

      此外还发现 89% 的 MOV10+m6A targets 与 DDX6-RIP-seq 重叠,命名为 MOV10+m6A+DDX6 targets ,57% 的 MOV10-m6A targets 与 DDX6-RIP-seq 重叠,命名为 MOV10- m6A+DDX6 targets :

      随后作者对这些不同的 gene sets 进行半衰期实验,发现 MOV10+DDX6 (4,009) 和 MOV10+m6A+DDX6 (1,914) targets 在 MV10 KO 后 半衰期显著增加 ,相反,MOV10 only targets (1,799) 在 MV10 KO 后 半衰期中等程度的下降,然而 MOV10-m6A+DDX6 targets (1,558) 和 MOV10 non-targets (7,764) 没有显著性的变化。

      表示 MOV10 除了 降解其自身结合 m6A 修饰的 mRNA, 还包括 DDX6 结合的含有 m6A 修饰的 mRNA。

      作者还验证翻译效率的变化,发现并没有显著变化:

      小结:

      综合以上结果表面,MOV10 介导了在 Pbody 的其结合的 m6A 修饰的降解过程。


      细胞系表型

      正常 mESC 细胞系的形态为圆形、圆顶形、呈3维形态生长,在敲除 MV10 以后,细胞形态变为扁平形,细胞接触减少,提示细胞已经 分化 或者 干性降低 。

      引起表型变化的机制?

      作者发现糖原合酶激酶-3ß(Gsk-3ß) 在 MV10 KO 后半衰期显著上升,而Gsk-3α (homologue of Gsk-3ß) 保持不变:

      GSK-3s:

      GSK-3s 家族功能报道为维持 mESC 的状态,GSK-3ß 能够维持 mESC 的自我更新。此外,抑制 GSK-3 可以通过稳定 ß-CATENIN 来激活经典的 WNT/ß-CATENIN 信号通路,后续激活下游靶标 NANOG 基因(ESC 细胞转录因子)。这条被认为是维持 mESC 状态自我更新的关键机制。

      基于以上背景研究,在 MOV10 KO 的 mESC 细胞系中,GSK-3 是如何调控 NANOG 的表达的呢?

      GSK-3ß 的 Ser9 磷酸化对于在 WNT/ß-CATENIN 通路中控制 ß-CATENIN 的降解非常重要。实验表示结果表明,在 Mov10 缺失的情况下,GSK-3ß Ser9 磷酸化的激活降低了 ß-CATENIN 的表达和 NANOG 的表达:

      这就永久的导致了细胞的表型,干性降低。(这里 GSK-3ß 的蛋白水平并没有太大变化,作者猜测 GSK-3ß 的水平维持还基于其它的通路)

      为了检测 MOV10 是否以 m6A 依赖的方式调控 Gsk-3ß mRNA 的降解,由 MOV10 KO 的 m6A-seq 数据分析结合 MOV10 KO 增加 Gsk-3ß 的半衰期可以得到证明:

      值得注意的是,MOV10 KO 后 NANOG 的 m6A 水平显著下降,但是其半衰期并没有变化,提示 MOV10 不是以 m6A 依赖的方式调控 NANOG 的 mRNA,然而 MOV10 通过 WNT/ß-CATENIN 通路来调解 NANOG 的蛋白水平。

      总结:

      1、本文通过 co-IP 筛选出新的 m6A 结合蛋白,并使用 RIP-seq、m6A-seq、RNA-seq 实验进行验证。

      2、为了探究其分子功能,构建了 WOV10 的 CRISPR 敲除基因,结合 m6A-seq、半衰期实验及 RIBO-seq、WOV10 的 co-IP 实验等等、验证 WOV10 以 m6A 依赖的方式破坏靶 mRNA 的稳定性或降解其靶 mRNA。

      3、最终发现 MOV10 以 m6a 依赖的方式破坏/降解 Gsk-3ß mRNA,稳定 WNT/ß-CATENIN 通路的 ß-CATENIN 蛋白表达,以保持下游 NANOG 的表达以维持 mESC 的状态。


      3、读后感

      实验比较全面,结构清晰明了,需要有一定的背景知识。MOV10 与 UPF1 互作介导无义介导的 mRNA 降解机制可以需要通过实验进一步验证,内容可以更加完善。

      收官!

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