[前期]无参转录组知识储备

豆豆写于19.1.25 

「现在的回忆」那时的我还没毕业，毕业课题也是自编自导自演，我选择的是无参转录组分析，在距离毕业还有不到5个月的时候，我才开始分析数据（之前的时间都用来学其他的了）。记得过年的时候开始在家下载公司的测序数据，开始学习怎么跑无参流程，边学边跑边整理边写论文（一篇大一篇小）。记得最后真的是灵感爆棚，用了14天写完的毕业论文。

「之前写的」

我喜欢在学东西时先学一些知识储备，现在不太喜欢拿来代码直接去跑，可能对背后的原理性东西想要做更多了解了。比如这个结果是怎么得到的？怎么看懂结果？我怎么才可以根据自己的需要获得部分结果。这些都需要很长的时间去积累，而流程，只要调试好就可以去跑，但即使不报错的结果也未必是对的，这一点需要注意

下面👇的一些链接需要打开原文链接查看~

先上文章

综述类：

• A survey of best practices for RNA-seq data analysis 
  https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-016-0881-8

• De novo transcript sequence reconstruction from RNA-Seq: reference generation and analysis with Trinity
  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3875132/

• RNAseq data analysis from data carpentry

• Great introduction of RNA-seq from sample preparation to data analysis
  RNA-seqlopedia

• RNA-seq differential expression & pathway analysis with Sailfish, DESeq2, GAGE, and Pathview

细节类：

• 关于样本数量：How many biological replicates are needed in an RNA-seq
  experiment and which differential expression tool should
  you use?
  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27022035

• 实验设计：https://www.biostars.org/p/65824/

• 后续标准化、定量、差异分析：
  Genome-wide repressive capacity of promoter DNA methylation is revealed through epigenomic manipulation

• 不比对直接定量：sleuth 、Kallisto 、Salmon: the sucessor of Salfish ~ Accurate, Versatile and Ultrafast Quantification from RNA-seq Data using Lightweight-Alignment.

转录组分析前期

这部分内容是测序公司经常说的内容，主要考虑以下三点

• 生物学重复的数量：至少三个以上的生物学重复

• 文库类型：

• mRNA片段如何获取？
  第一种：真核生物成熟的mRNA一般带有polyA尾巴，一般方式就是对具有PolyA尾巴的片段进行捕获。这种方法对mRNA的完整性要求比较高，如果样本发生了降解，那么就会丢失一定的转录组信息
  第二种：去除Total RNA中占比很高（超过90%）的rRNA，剩下的RNA中就有mRNA（约1-2%）。样本降解的影响比第一种要小，但需要更高的测序数据量因此成本会高【同时由于原核的mRNA没有polyA，所以只能用去除rRNA的方式】

• 是否需要链特异性文库？
  因为现在虽然是叫RNA-seq，但其实还是需要RNA反转录成cDNA然后扩增进行测序，最后是测得还是ATCG。
  第一种：利用普通文库。这种方法会同时测到模板链以及反向互补链的信息，不能判断原来的mRNA是什么方向（正链还是负链），既然确定链的来源有偏差，那么也对转录本的定量产生了影响
  第二种：利用链特异性文库。这种方法可以将建库过程产生的反向互补序列的文库直接去除掉，可以确定mRNA的来源链，转录本定量的准确性会更高

• 测序深度：

  主要考虑目标转录组的复杂度。低丰度的转录本的定量需要更高的测序深度，但是过高的测序深度也会带来转录本噪声。一般的测序结果中利用饱和曲线可以较好的评估测序深度是否合适

先研究研究流程、文章，最主要用的还是基于比对进行定量的trinity以及不基于比对进行定量的sleuth、kallisto，下一步开始介绍Trinity的使用，这可是一个非常大的套件