标准化进行时

豆豆写于18.10.19 今天看一看转录组的定量相关术语，简单了解一下吧
statquest 视频回复“fpkm”获得哦，视频也很有帮助哦

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. 首先看概念

• 我们做转录组很大程度上是为了看基因表达量差异的，那么什么是表达量？
  它肯定是用来看两组之间不同的一个标准，但这个标准怎么定义呢？

一个细胞中或者一定含量的RNA中，含有转录本的数目就是表达量

• 进行差异分析之前，我们必须要先知道每个基因各自在不同样本中有多少，也就是raw counts。当然有的软件可以直接用raw counts进行比较，（例如DeSeq2就要求表达量矩阵是整数组成的、未经下游标准化的）。但是还有一些是需要标准化以后才能用的比如edgeR，那么什么是标准化？

我们赛跑都要讲求公平吧，比较基因表达量也是如此。表达量受到测序深度和基因长度的影响

同一个基因在不同样本中，样本测序深度越高，也就相当于抽样的次数越多，当然抽到落在该基因的reads数就越多；

同一个样本中的不同基因，基因越长，被打断后得到的片段就越多，会有越多的reads会落在它上面；

为了让不同样本的基因或者不同基因在同一样本中进行比较，需要把它们放在统一的起跑线上
于是要把原始的表达量统计值转换成RPKM/FPKM/TPM等，来消除测序深度和基因长度的影响

• 过去一般使用RPKM（Reads Per Kilobase Million）或者FPKM（Fragments Per Kilobase Million）

好吧，不得不说这个命名让人很迷惑
深入了解一下：首先，M和K都是放在分母上的，
其次，上面的M也就是Million，用来排除测序的深度的影响；K也就是Kilobase排除是基因的长度的影响
最后，公式的意思也就清楚啦：就是用reads原始统计值处以总reads数和基因长度

• TPM（Transcripts per million）是更为推荐的

. 理解标准化

假如一开始得到的raw counts是这样的：一个样本3个重复，检测了4个基因

很明显，样本1.3中每个基因的值都明显高于1.1和1.2，另外B在所有样本中表达量都是A的2倍，当然，这些都是需要进行标准化的。看看标准化后是什么样子

1. 利用RPKM

• 首先，将测序深度进行标准化：计算每列的总和然后除以1,000,000【当然这里由于是编的数据，就使用10进行整除】
  

  

• 然后，将基因长度标准化，就是将上一步数据再中心化（scale函数可以做到）

  

• 最后得到的就是这样啦

  

2 . RPKM vs FPKM

只要知道：RPKM是单端数据使用，双端测序使用FPKM更合适

3 . TPM

先对每个基因的reads数用基因长度校正，然后用校正后的reads数除以所有reads总和，因此每个样本中的TPM的总和都是一样的，而FPKM则不相等

. 结论

RPKM及TPM的都考虑了基因长度，但基因长度对RNA-Seq差异比较结果并无极大影响。单一样本中TPM与RPKM的结果基本上是一致的，同一物种不同的样本FPKM标准化会相对弱一些（也就是相对粗放一些），不同物种的就不能比较啦。
更推荐使用TPM进行标准化，但现实情况是：FPKM使用仍然比较广泛