谈谈单细胞测序那些事儿

专题介绍：单细胞RNA-seq被评为2018年重大科研进展，但实际上这是老技术。2015年，商品化单细胞RNA测序流程已经建立，成果发表在Cell上。今年井喷式发文章，关注点那么高，是因为最近这项技术全面商品化了。

通过实战跟练的方法与大家一同学习单细胞测序数据分析。我是最近开始打算学学单细胞数据分析，毕竟是热点，毕竟关注的人也多。之前其实也陆陆续续的在讲座或者汇报中听到，感觉数据分析非常多，图片非常好看。我一个朋友去年就开始建议我多看看，觉得在国内目前是荒芜之地，但是现在看来都已经好多人开始做了。

最后我在总结前辈的基础上，结合自己的研究经历也谈谈单细胞测序那些事儿，如果有不对的地方欢迎加我微信cll7658或者扫码关注单细胞测序微信交流群实时交流，群里有大佬作为分析主力的项目发表在science的。

从单细胞层面分析生物学现象一直是生物医学研究的常见做法。包括我们做分子生物学实验培养细胞也是在单细胞群体的基础上进行实验。近年来，最火爆的单细胞高通量的技术莫过于单细胞测序了，那么常见的单细胞研究方法有哪些呢？

流式细胞技术

流式细胞技术是最常见的实验层面的单细胞研究技术。主要利用抗原抗体特异性结合的原理，将抗体偶联染料可被流式细胞仪器识别，最终将蛋白质表达量转为数据，供我们分析。

没有完美的技术，只有不断的探索新的突破。流式细胞技术虽然方便也很快用于临床检测，但是对于科学研究而言却能力不足。尤其是受到了荧光染料种类单次检测的限制，于是需要新的技术和设备。

Cytof质谱流式细胞技术

该技术与传统的流式细胞技术原理相同，最大的不同在于抗体偶联的染料是金属元素，极大的改善光谱，改善流式细胞痛点荧光遗漏问题，可以单次检测更多的蛋白。例如，基于该技术骨髓内免疫细胞得到了高分辨的分群，这在之前的流式细胞技术中是达不到或者是非常复杂的实验设计的。
在蛋白检测的过程中，也有一类特殊的需求，就是单个细胞的拍照，因为流式细胞加入了荧光，因而很容易让人联想到两者的应用，因此也出现了图像流式的存在，这类的应用主要在循环肿瘤细胞的鉴定中。由于科研应用较少所以在这里不做重要介绍。

以上质谱流式细胞技术与图像流式细胞技术均可以解决相应的问题，但是在检测指标上并没有带来太大的进步。基于RNA seq转录测序火爆的情况，开发了单细胞测序技术。

单细胞测序技术

根据取样的不同，单细胞测序技术分为单细胞转录组测序技术和单细胞空间转录组测序技术，当然还有更加的细分，比如smart seq2，ATAC等，我们这里只介绍符合10x规范的单细胞数据分析，这应该也是一个趋势。

讲了这么多，很明显各个技术都有他的优势，流式细胞方便快捷，流式质谱在方便快速的基础上可以达到更多指标的检测，单细胞测序则可以更多指标就是全基因的方式进行单细胞的检测。

单细胞测序一般用的是极限稀释的方法，用条码（即一条基因来标记耽搁细胞），然后扩增建库后进行统一的测序，后面根据条码就可以知道具体的某一个特点了。当然这都是大白话，感兴趣的可以去10x的官方网站慢慢看。单细胞测序的类型也多，以下是两种，但是由于刚开始我主要看单细胞RNA-seq测序部分。

单细胞转录组测序

单细胞转录组测序顾名思义就是基于单个细胞的转录水平的测序，利用的原理就是经典的油包水检测原理，将细胞打散然后进行耽搁细胞的建库分析。这样的情况下每一个细胞就相当于一个样本来进行测序和分析，但是更准确来说一个细胞更像是一个细胞系，所以这些细胞系有可能相同又有可能有微小变化。

单细胞空间转录组测序

单细胞空间转录组测序核心技术与单细胞准路测序一致，只是在取样上需要根据组织结构进行，因而涵盖了更多的信息，当然需要的人力和资金自然更多。
注：我也是仅仅根据我个人的理解，详细的信息你可以搜索官方介绍和各大搜索引擎。

除去科研想法和实验过程以外，研究的重中之重在数据分析，从不同的角度来解释自己的或者已经有的数据都可以得到好的产出。

测序我们必须谈分析，但是对于单细胞测序相对于bulk测序来说，最大的差别应该是分类别的分析，类越小越好，越有意义越好。你必入可以定义某一癌症的起决定杀伤作用的某一基因高表达的CD8+细胞。

单细胞数据分析

实际上目前单细胞测序基本都是商业公司上门处理和检测的，并且一般会给出常规分析报告。所以后续的重中之重就是放在测序数据的分析上。我会在后面分步骤的一个个来说明。主要如下：

1. 单细胞测序计算环境配置，当然是配置越高越好的。
2. 单细胞数据获取（自测数据以及五花八门的数据库下载数据的整理和清洗）
3. R/Seurat包对数据处理（由于网络上说Seurat教程的pbmc数据太多了，我介绍基于肿瘤样本）
4. 复杂细胞的定义marker
5. cellphone细胞通讯分析
6. monocal3细胞轨迹分析
7. pysenic重要转录因子的筛选
8. 在TCGA数据库中验证单细胞测序的重要结论
9. 以上只是简单的我现在梳理的在具体的赖尿虾过程中应该还有很多，也会碰到很多问题，欢迎大家加入群一起解决讨论。

最后再总结和强调一下，分组和分群研究是重中之重，这是我们研究不同功能的基础。