参考： https://www.jianshu.com/p/57363936bc35

1.甲基化数据标准化问题

1.1 引言

异常的DNA甲基化与癌的发生发展密切相关，因此在全基因组范围内识别癌相关的差异甲基化基因可以分析疾病发生的分子机制、发现用于疾病诊断与药物靶设计的生物学标志。然而，利用甲基化芯片检测的高通量数据往往受诸如试剂与检测批次、不同操作者等多种因素的影响。通常认为这些技术变异可能降低检测生物信号的统计效能，因此需要对数据进行标准化处理来减少技术变异对数据的影响。为了排除技术因素的影响，针对基因表达谱数据处理开发的标准化方法如Quantile标准化和Lowess等常被应用于甲基化谱预处理中。这些标准化方法将所有的样本的信号值都标准化到相同的分布或者使之具有相同的中值，为此通常需要假设在疾病样本中差异表达的基因很少并且差异高表达和低表达的基因数目大致相等。我们最近的研究显示在癌表达谱数据中包含大量上调表达的基因，采用这些传统假设的标准化方法会失查很多癌相关的上调差异表达基因并且发现很多假的下调差异表达基因，因此需要采用不依赖于如前所述假设的数据标准化方法如LVS等。许多研究者认为癌基因组呈现广泛的低甲基化状态，因此将癌样本和正常样本统一归一化的标准化方法可能会扭曲真实的生物学信号。对此问题，研究者并未达成共识。一些研究人员在分析DNA甲基化芯片数据时选择不进行标准化处理，而大部分研究者仍然采用常规的标准化方法对甲基化芯片数据进行预处理。不同的处理方法可能对筛选差异甲基化基因等后续分析有重要的影响，有必要进行全面的评估。

在本论文中，我们通过分析四种癌型的各两套甲基化谱数据，发现癌症样本与正常样本的原始信号值（beta值）的中值无显著差异。然而，我们发现八套甲基化数据中有七套数据癌症样本下的75分位数是低于正常样本的，并且其中有三套甲基化数据癌症样本的75分位数显著低于正常样本，暗示了基因在癌症中有一定程度的低甲基化倾向。尽管如此，基于原始信号值和Quantile (Lowess)标准化后信号值筛选出来的差异甲基化基因交叠比例很高，并且改变方向（高甲基化或低甲基化）高度一致。我们发现基于Quantile(Lowess)标准化后信号值可以筛选出更多的差异甲基化基因，而且这些基因的改变方向与其对应的原始信号的改变方向高度一致，提示采用Quantile(Lowess)标准化可以提高识别差异甲基化基因的统计效能并且并未对甲基化数据造成严重的偏倚。此外，我们发现由同一种癌型的不同数据集得到的差异甲基化基因的改变方向呈现高度一致性，提示利用甲基化谱可以可靠地发现癌症中甲基化的改变方向。

1.2 标准化算法

1.2.1 Quantile算法

Quantile标准化的目的是使当前所有样本微阵列上的探针强度分布保持一致。它所基于的统计思想是如果2个n维数据向量X、Y具有相同的数据分布，那么基于这2个向量的Quantile-Quantile图应该是平行于对角线的直线，可以将数据向量投影至对角线上来获得相同的数据分布。假设说，微阵列个数为n，每个微阵列上有p维的探针数据强度值，则构造出一个p*n维的强度矩阵N，将矩阵的每列数值排序，得到矩阵Nsort，其中q_k=(q_k1,…,q_kn)(k=1,…,p)对应于矩阵Nsort的第k个行向量，将其投影到向量：d=(1/sqrt(n),…1/sqrt(n))xn得到：

以此作为新矩阵，再将其每列的数据按最初顺序重新排序，得到最后的标准化的矩阵，该矩阵的列向量之间保证了不同的数据分布。具体的讲，用每个芯片的最大值的中位数或均值来替换每个芯片上的最大值，用每个芯片的第二大值的中位数或均值来替换每个芯片上的第二大值，以此类推。对每个点都完成这些操作之后，即可得到标准化的数据。由于，Quantile算法能够获得与其它复杂的标准化算法相同甚至更好的效果，并且其计算简单，因而该标准化被广泛地采用。

1.2.2 Lowess算法

Lowess (Locally Weighted Linear Regression normalization，局部加权回归分析) 是一种非参数回归方法，也称为平滑方法，在计算两个变量的关系时采用开放式算法，所拟合的曲线可以很好的描述变量之间关系的细微的变化。比如在分析某一点(x,y)的变量关系时，Lowess 回归的步骤如下：（1）首先确定以x 为中心的一个区间(Window)内参加局部回归的观察值的个数q。 q 值设的越高则得到的拟和曲线越平滑，但对变量关系的细微变化越不敏感。小的q 值会对细微的变化很敏感，但是得到的拟和曲线变得很粗糙。（2）定义区间内所有点的权数，权数由权数函数来决定，任一点的权数是权数函数的曲线的高度。（3）对每个区间内的q 个散点拟和一条直线，拟合曲线描述这个区间内的变量关系。 （4）拟合值y 值就是在x 点的y 的拟合值。依照上面四个步骤，所有的点都计算拟合值，最终得到一组平滑曲线的平滑点，最后 在把这些平滑点用短直线连接起来，就得到了Lowess 的回归曲线。