欢迎定制 |可定量的单碱基分辨率m6A甲基化图谱
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在170多种已知的RNA修饰中,N6-methyladenosine(m6A)是最丰富的mRNA修饰,其调节多种转录后过程,如mRNA降解、mRNA翻译、pre-mRNA剪切和pri-miRNA加工等。另一个突出的RNA修饰是N6,2′-O-dimethyladenosine(m6Am),其位于mRNA的第一个核苷酸处,与mRNA 帽相邻的2’-O-甲基腺苷的碱基甲基化形成(图1),m6Am能够抵抗DCP2介导的mRNA降解以稳定mRNA。

在研究m6A时,m6A RNA免疫沉淀测序(m6A-RIP-seq)是最常用的m6A测序方法,但其分辨率较差(~150nt)。单碱基分辨率的m6A测序技术已经被开发,但之前技术主要利用交联和免疫沉淀m6A特异性抗体,进行反转录并在m6A位点诱导截断或突变。涉及的过程较繁琐,如放射性凝胶电泳。此外,没有对照以纠正抗体免疫沉淀的效率或标准化。为克服之前方法的技术局限性,新的m6A测序方法已被开发。
本次分享的是新加坡基因研究所W. S. Sho Goh课题组于2019年12月10日在Nature Communication上发表的Atlas of quantitative single-base-resolution N6-methyl-adenine methylomes文章 [2],他们开发了名为m6A-Crosslinking-Exonuclease-sequencing (m6ACE-seq) 的m6A测序方法,并对各种m6A甲基化酶与去甲基化酶以及m6Am甲基化酶的m6A/m6Am图谱进行了分析。

m6ACE从m6A开始富集RNA片段
由于m6A RNA与6mA DNA之间结构的相似性,作者利用他们之前报道过的单碱基分辨率6mA测序方法来开发m6ACE-seq。即先将抗m6A抗体光交联到含有m6A的RNA上,从而保护其免受之后的5’到3’的核糖核酸酶处理(图2a)作者首先合成一个RNA寡核苷酸对m6ACE-seq测试,寡核苷酸的21位含有一个m6A核苷酸。m6ACE处理组与对照组相比,m6ACE的reads堆积正好处在m6A位置的开始(图2b)。此外,对人HEK293T细胞提取RNA进行m6ACE-seq,重点研究18S和28S rRNA,它们各自具有一个m6A位点。同样观察到18S rRNA和28S rRNA m6A位置的m6ACE特异性reads起点(图2c、d)。这些m6ACE-seq图谱表明,m6ACE处理可用于定位RNA中m6A的确切位置。

接着,作者利用m6ACE-seq在人类转录组中鉴定出33163个重要位点。对m6A位点进行基因表达分析,概括了定位情况(图2e),m6A主要集中在CDS和3’UTR附近。另外m6A位点周围序列的共识motif分析,还描绘了“DRm6ACH“motif,这是人类m6A位点的典型特征(图2f)。
另外,作者注意到线粒体16S rRNA中存在一个m6A候选位点,该位点在之前的单碱基分辨率的甲基化组中未发现(图3i)。为验证此候选位点,作者利用基于T3-DNA-连接酶的m6A检测方法,其中DNA探针重组到检测位点的侧翼序列,探针的连接效率与位点处的甲基化水平成负相关(图3j)。与没有m6ACE信号的两个单独16S rRNA位点比较,候选m6A位点侧翼的探针连接效率降低了约29倍,从而将其验证为新的m6A位点(图3i、k)。这些发现表明,m6ACE-seq能够对已鉴定的和新的m6A位点在转录组范围内进行单碱基分辨率的定位。

m6ACE-seq定量映射METTL3依赖的m6A
在优化m6ACE-seq的过程中,作者将合成的甲基化RNA加到生物RNA样品中,以实现样品间m6ACE效率的标准化,并用带有 unique molecular identifiers(UMI)的测序adaptor来校正文库扩增的偏倚。利用这些归一化和校正步骤,即可计算样品之间单个m6A候选位点的相对甲基化水平(RML)。
为了检测m6ACE-seq能否量化不同样品之间的m6A甲基化差异,作者使用CRISPR-Cas9敲除METTL3,以检测RNA是否会通过m6ACE-seq表现出依赖METTL3 m6A的丢失。在没有METTL3表达的情况下,观察到15073个m6A位点表现出显著的RML降低(图4a)。对单个基因的分析显示,这些m6A主要处在终止密码子附近的3’UTR中,“DRm6ACH“motif处的m6ACE-seq 起始reads明显丢失(图4b)。结果显示,METTL3依赖型的m6A位点更集中定位在终止密码子(图4c)。METTL3依赖型的m6A位点的共有motif分析也描绘了与METTL3 m6A相关的”DRm6ACH“ motif(图4d),验证了m6ACE-seq的准确性。

对于任何给定的m6A位点,只有一小部分转录本的分子被甲基化。为了评估m6ACE-seq量化样品间差异甲基化的能力,作者混合了不同比例的WT和METTL3-KO RNA,以便在整个转录组范围内模拟体内转录本甲基化的不同分数。随着RNA混合物中WT RNA的比例减少,在各个m6A位点的m6ACE-seq reads数也相应减少(图4e)。在全转录组水平上,标准化的相对甲基化水平与混合物中存在的WT RNA的百分比呈线性相关(图4f)。这表明m6ACE-seq能够量化不同样品中每个m6A位点的差异甲基化分数。
m6ACE-seq定量映射PCIF1依赖的m6Am
接下来,作者试图确定m6ACE-seq能否定位m6Am。对先前显示含有m6Am的组蛋白mRNA进行m6ACE-seq,结果在组蛋白mRNA的第一个核苷酸或附近观察到清晰的reads堆积,表明存在m6Am。另外之前观察到在METTL3-KO细胞中仍未减弱的mRNA 5’UTR内的强reads信号(图4b)。考虑到其在TSS附近的定位以及其与METTL3独立性,这些m6ACE-seq的reads读数可能代表位于第一个核苷酸中的m6Am位点。这就突出了m6ACE-seq的另一个作用,识别m6Am。
PCIF1具有N6-甲基腺嘌呤甲基转移酶结构域,作者对PCIF1-KO RNA进行m6ACE-seq处理,发现PCIF1消耗导致m6Am所在的5’UTR内位点相对甲基化水平的消除(图5a、g)。如果PCIF1特异地催化与mRNA帽相邻的m6Am甲基化,那么METTL3依赖型m6A位点应该能够抵抗PCIF1的耗竭。结果,METTL3依赖型m6A在PCIF1-KO细胞中未显示任何RML的降低(图5a)。全转录组分析,发现PCIF1依赖的位点有4264个(图5b)。对这些功能注释基因的进行富集分析,发现其集中于RNA加工和线粒体翻译过程(图5c)。与依赖METTL3的m6A不同,PCIF1依赖的位点在mRNA的定位主要在5‘UTR(图5d)。同时还表现出“CABU”的共有motif,其是TSS处启动子共有序列“BBCABW”序列的一个子集。这些分析充分验证PCIF1相关的位点为TSS相关的m6Am。

进一步,作者利用低分辨率的m6A测序技术发现,鉴定出的PCIF1依赖型m6A位点与非PCIF1依赖型m6A位点具有很大的重叠(图5f)。观察这些重叠的5’UTR,可以发现由于m6Am位点靠近m6A位点,低分辨率m6A测序方法无法检测PCIF1耗竭后m6Am甲基化的损失,从而导致假阴性。
METTL16耗竭降低总RNA甲基化
METTL16是另一种m6A甲基转移酶,介导“UACm6AGAGAA” motif中的m6A甲基化。Mat2a编码S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶,其3’UTR具有5个“UACAGAGAA”位点。但是先前低分辨率的m6A-RIP-seq绘制该区域的m6A位点时,仅产生了4个取决于METTL16的峰。作者敲低了METTL16的表达并提取RNA进行m6ACE-seq。首先关注Mat2a转录本,发现了清晰的5个“UACAGAGAA”位点(图6a、b)。同样,对整个转录组进行分析,找到602个METTL16依赖型m6A位点。但METTL16诱导Mat2a转录物的剪切和MAT2A蛋白的表达也合成SAM,所以METTL16的丢失会导致整个转录组范围内m6A甲基化的缺失。因此,METTL16依赖型m6A位点并不表现出唯一的定位模式(图6d)。METTL16相关的m6A一半以上被共同鉴定为METTL3相关的m6A(图6f)。同样很大一部分也被鉴定为PCIF1依赖型m6Am(图6g)。总的来说,METTL16可以通过控制细胞内SAM的水平,间接介导了大多数的METTL16依赖型m6A。

ALKBH5抑制m6A积累
接着作者又对去甲基化酶ALKBH5进行了研究,在ALKBH5-KO细胞中,m6ACE-seq鉴定出了具有RML积累的m6A。在ALKBH5耗竭后,RML在各个“DRm6ACH”位点的积累(图7a),motif分析表明,ALKBH5调控的位点也表现出与METTL3依赖型m6A相似的共有motif(图7d)。如果ALKBH5调控的位点是动态的,则应该表现出动态的RML范围,不仅在ALKBH5-KO细胞中表现出积累,并且应在METTL3耗竭的细胞中减少。但几乎没有ALKBH5调控的位点被共同鉴定为METTL3依赖型位点(图7e)。进一步,作者绘制了receiver-operator-characteristics (ROC) 曲线,以了解ALKBH5调控位点在WT细胞中甲基化缺失的情况。结果表明,ALKBH5调控的位点越强,WT细胞在稳态下未甲基化的可能性就越高(图7f)。这些发现与ALKBH5调控位点是动态的模型相矛盾,表明ALKBH5持续作用于调控位点,使其在WT条件下保持恒定的未甲基化状态。

FTO丢失导致m6Am积累
作者同样对FTO去甲基化酶进行了检测,发现FTO同时能够降低m6Am和m6A水平,并且与ALKBH5同样,为持续的作用。FTO-KO没有导致任何snRNA的相对RNA水平的显著变化,但snRNA的成熟涉及细胞核和细胞质之间的易位,因此,作者分离核与细胞质部分,并对其细胞定位进行了量化,发现U1和U4 snRNAs更局限在细胞核中(图8e)。这种核定位的增加可能是抑制了初始前体snRNA的核输出,作者测试m6Am积累是否会影响snRNA与NCBP2的结合,发现NCBP2与FTO-KO U4 snRNA的结合比WT U4 snRNA的结合弱约6倍(图8f)。因此在不存在FTO的情况下,U4 snRNA的第一个核苷酸中的m6Am甲基化积累会破坏相邻snRNA帽与NCBP2的结合,从而影响其定位。

总结
作者设计了利用核酸酶与m6A抗体的单碱基分辨率的m6A测序方法—m6ACE-seq,并利用这个方法对细胞内的多种甲基化酶与去甲基化酶进行研究。另外,对m6A与m6Am是否是可逆过程进行了讨论。基于甲基化图谱的分析,大多数的甲基化RNA不会进行去甲基化,而是保持甲基化直至降解。某些RNA位点的甲基化会破坏下游RNA的加工途径,因此这些位点需要保持未甲基化,提出了m6A调控的新理解。
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