欢迎定制 |可定量的单碱基分辨率m6A甲基化图谱

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在170多种已知的RNA修饰中，N6-methyladenosine（m6A）是最丰富的mRNA修饰，其调节多种转录后过程，如mRNA降解、mRNA翻译、pre-mRNA剪切和pri-miRNA加工等。另一个突出的RNA修饰是N6,2′-O-dimethyladenosine（m6Am），其位于mRNA的第一个核苷酸处，与mRNA 帽相邻的2’-O-甲基腺苷的碱基甲基化形成（图1），m6Am能够抵抗DCP2介导的mRNA降解以稳定mRNA。

在研究m6A时，m6A RNA免疫沉淀测序（m6A-RIP-seq）是最常用的m6A测序方法，但其分辨率较差（~150nt）。单碱基分辨率的m6A测序技术已经被开发，但之前技术主要利用交联和免疫沉淀m6A特异性抗体，进行反转录并在m6A位点诱导截断或突变。涉及的过程较繁琐，如放射性凝胶电泳。此外，没有对照以纠正抗体免疫沉淀的效率或标准化。为克服之前方法的技术局限性，新的m6A测序方法已被开发。

本次分享的是新加坡基因研究所W. S. Sho Goh课题组于2019年12月10日在Nature Communication上发表的Atlas of quantitative single-base-resolution N6-methyl-adenine methylomes文章 [2]，他们开发了名为m6A-Crosslinking-Exonuclease-sequencing (m6ACE-seq) 的m6A测序方法，并对各种m6A甲基化酶与去甲基化酶以及m6Am甲基化酶的m6A/m6Am图谱进行了分析。

m6ACE从m6A开始富集RNA片段

由于m6A RNA与6mA DNA之间结构的相似性，作者利用他们之前报道过的单碱基分辨率6mA测序方法来开发m6ACE-seq。即先将抗m6A抗体光交联到含有m6A的RNA上，从而保护其免受之后的5’到3’的核糖核酸酶处理（图2a）作者首先合成一个RNA寡核苷酸对m6ACE-seq测试，寡核苷酸的21位含有一个m6A核苷酸。m6ACE处理组与对照组相比，m6ACE的reads堆积正好处在m6A位置的开始（图2b）。此外，对人HEK293T细胞提取RNA进行m6ACE-seq，重点研究18S和28S rRNA，它们各自具有一个m6A位点。同样观察到18S rRNA和28S rRNA m6A位置的m6ACE特异性reads起点（图2c、d）。这些m6ACE-seq图谱表明，m6ACE处理可用于定位RNA中m6A的确切位置。

接着，作者利用m6ACE-seq在人类转录组中鉴定出33163个重要位点。对m6A位点进行基因表达分析，概括了定位情况（图2e），m6A主要集中在CDS和3’UTR附近。另外m6A位点周围序列的共识motif分析，还描绘了“DRm6ACH“motif，这是人类m6A位点的典型特征（图2f）。

另外，作者注意到线粒体16S rRNA中存在一个m6A候选位点，该位点在之前的单碱基分辨率的甲基化组中未发现（图3i）。为验证此候选位点，作者利用基于T3-DNA-连接酶的m6A检测方法，其中DNA探针重组到检测位点的侧翼序列，探针的连接效率与位点处的甲基化水平成负相关（图3j）。与没有m6ACE信号的两个单独16S rRNA位点比较，候选m6A位点侧翼的探针连接效率降低了约29倍，从而将其验证为新的m6A位点（图3i、k）。这些发现表明，m6ACE-seq能够对已鉴定的和新的m6A位点在转录组范围内进行单碱基分辨率的定位。

m6ACE-seq定量映射METTL3依赖的m6A

在优化m6ACE-seq的过程中，作者将合成的甲基化RNA加到生物RNA样品中，以实现样品间m6ACE效率的标准化，并用带有 unique molecular identifiers（UMI）的测序adaptor来校正文库扩增的偏倚。利用这些归一化和校正步骤，即可计算样品之间单个m6A候选位点的相对甲基化水平（RML）。

为了检测m6ACE-seq能否量化不同样品之间的m6A甲基化差异，作者使用CRISPR-Cas9敲除METTL3，以检测RNA是否会通过m6ACE-seq表现出依赖METTL3 m6A的丢失。在没有METTL3表达的情况下，观察到15073个m6A位点表现出显著的RML降低（图4a）。对单个基因的分析显示，这些m6A主要处在终止密码子附近的3’UTR中，“DRm6ACH“motif处的m6ACE-seq 起始reads明显丢失（图4b）。结果显示，METTL3依赖型的m6A位点更集中定位在终止密码子（图4c）。METTL3依赖型的m6A位点的共有motif分析也描绘了与METTL3 m6A相关的”DRm6ACH“ motif（图4d），验证了m6ACE-seq的准确性。

对于任何给定的m6A位点，只有一小部分转录本的分子被甲基化。为了评估m6ACE-seq量化样品间差异甲基化的能力，作者混合了不同比例的WT和METTL3-KO RNA，以便在整个转录组范围内模拟体内转录本甲基化的不同分数。随着RNA混合物中WT RNA的比例减少，在各个m6A位点的m6ACE-seq reads数也相应减少（图4e）。在全转录组水平上，标准化的相对甲基化水平与混合物中存在的WT RNA的百分比呈线性相关（图4f）。这表明m6ACE-seq能够量化不同样品中每个m6A位点的差异甲基化分数。

m6ACE-seq定量映射PCIF1依赖的m6Am

接下来，作者试图确定m6ACE-seq能否定位m6Am。对先前显示含有m6Am的组蛋白mRNA进行m6ACE-seq，结果在组蛋白mRNA的第一个核苷酸或附近观察到清晰的reads堆积，表明存在m6Am。另外之前观察到在METTL3-KO细胞中仍未减弱的mRNA 5’UTR内的强reads信号（图4b）。考虑到其在TSS附近的定位以及其与METTL3独立性，这些m6ACE-seq的reads读数可能代表位于第一个核苷酸中的m6Am位点。这就突出了m6ACE-seq的另一个作用，识别m6Am。

PCIF1具有N6-甲基腺嘌呤甲基转移酶结构域，作者对PCIF1-KO RNA进行m6ACE-seq处理，发现PCIF1消耗导致m6Am所在的5’UTR内位点相对甲基化水平的消除（图5a、g）。如果PCIF1特异地催化与mRNA帽相邻的m6Am甲基化，那么METTL3依赖型m6A位点应该能够抵抗PCIF1的耗竭。结果，METTL3依赖型m6A在PCIF1-KO细胞中未显示任何RML的降低（图5a）。全转录组分析，发现PCIF1依赖的位点有4264个（图5b）。对这些功能注释基因的进行富集分析，发现其集中于RNA加工和线粒体翻译过程（图5c）。与依赖METTL3的m6A不同，PCIF1依赖的位点在mRNA的定位主要在5‘UTR（图5d）。同时还表现出“CABU”的共有motif，其是TSS处启动子共有序列“BBCABW”序列的一个子集。这些分析充分验证PCIF1相关的位点为TSS相关的m6Am。

进一步，作者利用低分辨率的m6A测序技术发现，鉴定出的PCIF1依赖型m6A位点与非PCIF1依赖型m6A位点具有很大的重叠（图5f）。观察这些重叠的5’UTR,可以发现由于m6Am位点靠近m6A位点，低分辨率m6A测序方法无法检测PCIF1耗竭后m6Am甲基化的损失，从而导致假阴性。

METTL16耗竭降低总RNA甲基化

METTL16是另一种m6A甲基转移酶，介导“UACm6AGAGAA” motif中的m6A甲基化。Mat2a编码S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶，其3’UTR具有5个“UACAGAGAA”位点。但是先前低分辨率的m6A-RIP-seq绘制该区域的m6A位点时，仅产生了4个取决于METTL16的峰。作者敲低了METTL16的表达并提取RNA进行m6ACE-seq。首先关注Mat2a转录本，发现了清晰的5个“UACAGAGAA”位点（图6a、b）。同样，对整个转录组进行分析，找到602个METTL16依赖型m6A位点。但METTL16诱导Mat2a转录物的剪切和MAT2A蛋白的表达也合成SAM，所以METTL16的丢失会导致整个转录组范围内m6A甲基化的缺失。因此，METTL16依赖型m6A位点并不表现出唯一的定位模式（图6d）。METTL16相关的m6A一半以上被共同鉴定为METTL3相关的m6A（图6f）。同样很大一部分也被鉴定为PCIF1依赖型m6Am（图6g）。总的来说，METTL16可以通过控制细胞内SAM的水平，间接介导了大多数的METTL16依赖型m6A。

ALKBH5抑制m6A积累

接着作者又对去甲基化酶ALKBH5进行了研究，在ALKBH5-KO细胞中，m6ACE-seq鉴定出了具有RML积累的m6A。在ALKBH5耗竭后，RML在各个“DRm6ACH”位点的积累（图7a），motif分析表明，ALKBH5调控的位点也表现出与METTL3依赖型m6A相似的共有motif（图7d）。如果ALKBH5调控的位点是动态的，则应该表现出动态的RML范围，不仅在ALKBH5-KO细胞中表现出积累，并且应在METTL3耗竭的细胞中减少。但几乎没有ALKBH5调控的位点被共同鉴定为METTL3依赖型位点（图7e）。进一步，作者绘制了receiver-operator-characteristics (ROC) 曲线，以了解ALKBH5调控位点在WT细胞中甲基化缺失的情况。结果表明，ALKBH5调控的位点越强，WT细胞在稳态下未甲基化的可能性就越高（图7f）。这些发现与ALKBH5调控位点是动态的模型相矛盾，表明ALKBH5持续作用于调控位点，使其在WT条件下保持恒定的未甲基化状态。

FTO丢失导致m6Am积累

作者同样对FTO去甲基化酶进行了检测，发现FTO同时能够降低m6Am和m6A水平，并且与ALKBH5同样，为持续的作用。FTO-KO没有导致任何snRNA的相对RNA水平的显著变化，但snRNA的成熟涉及细胞核和细胞质之间的易位，因此，作者分离核与细胞质部分，并对其细胞定位进行了量化，发现U1和U4 snRNAs更局限在细胞核中（图8e）。这种核定位的增加可能是抑制了初始前体snRNA的核输出，作者测试m6Am积累是否会影响snRNA与NCBP2的结合，发现NCBP2与FTO-KO U4 snRNA的结合比WT U4 snRNA的结合弱约6倍（图8f）。因此在不存在FTO的情况下，U4 snRNA的第一个核苷酸中的m6Am甲基化积累会破坏相邻snRNA帽与NCBP2的结合，从而影响其定位。

总结

作者设计了利用核酸酶与m6A抗体的单碱基分辨率的m6A测序方法—m6ACE-seq，并利用这个方法对细胞内的多种甲基化酶与去甲基化酶进行研究。另外，对m6A与m6Am是否是可逆过程进行了讨论。基于甲基化图谱的分析，大多数的甲基化RNA不会进行去甲基化，而是保持甲基化直至降解。某些RNA位点的甲基化会破坏下游RNA的加工途径，因此这些位点需要保持未甲基化，提出了m6A调控的新理解。

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