(未测试)ATAC-seq分析干货-1

ATAC-seq技术由于其要求细胞量少，实验简单、快速、高效且应用范围广，是近年来转录调控、表观遗传修饰研究的一项重要的技术手段。近两年应用ATAC-seq方法发表的文章数量也是飞速上升，可见ATAC-seq的火爆程度。现在，如果你还不了解ATAC，还不抓紧学起来！今天我们先来学习一下ATAC-seq相关的背景介绍。

背景介绍

1 染色质可及性介绍

在介绍ATAC-seq之前，不得不提的就是染色质可及性的概念。大家知道，真核生物的DNA会与组蛋白结合形成核小体，核小体进一步压缩折叠形成具有高级结构的染色体，染色体的高级结构在细胞周期的不同的时期压缩折叠程度不同，间期比较松散，此时的状态被称为染色质，用于和中期高度压缩的染色体进行区分。

研究者发现DNA内切酶可以对染色质进行切割，这些切割位点称为DNA超敏感位点。DNA超敏感位点位于没有组蛋白包裹的DNA片段上，这些位点的分布往往具有一定的规律性——切割后的DNA片段都在100-200bp左右。这些可以被切割下来的裸露的100-200bp的DNA片段称为开放染色质。后期进一步的研究发现，开放染色质通常是转录因子、增强子、绝缘子或者其他调控蛋白结合的片段，结合的过程仿佛是触发了细胞内的开关，可以影响细胞内基因复制以及调控基因的转录活性。DNA的这种被结合的特性称为染色质的可及性（chromatin accessibility）。

染色质的可及性是近些年的研究热点。由于染色质的开放程度是动态变化的，这种变化是影响基因表达调控的关键决定因素，在细胞分化、发育以及各类疾病的发生发展研究中具有重要的作用。

2 染色质可及性技术

目前研究染色质可及性的方法总结主要有以下几种技术：MNase-seq、DNase-seq、FAIRE-seq、NOMe-seq以及ChIP-seq和ATAC-seq技术。

MNase-seq^[1]是使用内切核糖酶–微球菌核酸酶(micrococcal nuclease, MNase)处理染色质，由于MNase同时具备核酸外切酶和内切酶活性，所以在对DNA进行消化时，会将裸露的DNA全部切割掉，直到遇到核小体或DNA结合蛋白等阻遏物保护，因此MNase-seq技术是将含有核小体包裹的区域切割下来进行测序，然后通过反向比较获得开放染色质区域。
DNase-seq^[2]与MNase-seq技术互补，利用脱氧核糖核酸酶(DNaseI)识别DNaseI敏感位点，将裸露的DNA片段切割下来进行测序。
FAIRE-seq^[3]技术是利用甲醛将染色质中裸露的DNA进行固定，随后进行超声波打断，再利用传统的DNA提取方法——酚氯仿抽提，来分离打断的DNA，从而进行高通量测序。
NOMe-seq^[4]技术是通过人工甲基化修饰的方法进行核小体定位。使用GpC甲基转移酶处理固定的染色质，使未被核小体以及其他结合蛋白保护的GpC二核苷发生甲基化，由于基因组中含有大量的GpC，通过酶的处理可对核小体足迹进行高分辨的定位。
ChIP-seq^[5]技术是通过染色质免疫共沉淀及时特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段进行高通量测序，常用于特定转录因子或组蛋白特异性修饰位点的研究。
ATAC-seq^[6]技术通过转座酶Tn5容易结合在开放染色质（未经蛋白或核小体保护的DNA部位）的特性，在整个基因组范围内对Tn5酶捕获到的DNA片段进行高通量测序。

ATAC-seq技术介绍

1 技术原理

ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing)，利用超活性的Tn5转座酶容易结合在开放染色质的特性，通过Tn5酶切割基因组，在对切割下来的序列形成的转座酶复合物上，连接测序的barcode，构建成测序文库，并对测序文库进行测序，获得结合区域相关信息

2 优势

建库简单快捷，耗时短，重复性好
需要的细胞数目较少（一般500-50000个）
全基因组范围内检测
同时检测开放的DNA区域和被核小体占据的区域

3 ATAC-seq实验的几个建议

良好的实验设计以及操作是ATAC-seq成功的关键，关于实验策略有如下建议^[8]：

生物学重复：最好有两个生物学重复，而且2个重复足够了
对照：最好使用对照，可以用不使用转座酶Tn5处理的样本做对照
PCR扩增：扩增次数尽量少，以减少PCR引入dup
数据量：测序数据量一般跟基因组大小有关，对于人类样本，推荐50M/样本。一般来说测序数据越多，比对结果会越准确，尤其对于复杂基因组，如：高重复基因组，可以提升比对准确性
测序策略：推荐使用paired-end，原因有以下几个方面
- 能够更准确的鉴定转座酶的插入位置，确定插入片段长度。单端测序虽然可以通过计算模型去推断片段长度，但是没有那么准确
- 双端测序对于比对软件，更容易更准确的鉴定dup的reads，提高分析结果的准确性

分析步骤

1 原始下机数据的过滤质控

背景中介绍到，用来结合转录因子的染色质开放区域一般为100-200bp的小片段。随着测序技术的发展，我们ATAC-seq进行的高通量测序的策略一般是PE150（之前大部分为SE50），因此双端测序能测的插入片段大约在350bp左右。在这种情况下，我们实际测出的reads会把Tn5酶捕获到的片段测通，为了最大程度的利用测序数据，我们在数据清洗过程中一般会用Trim的形式进行过滤，即将reads中判断为接头的部分截取掉。

过滤的主要目的：
- 去除接头污染
- 去除低质量reads
使用Trimmomatic软件进行过滤

java -Xms1G -Xmx10G -XX:ParallelGCThreads=4 -jar trimmomatic-0.36.jar PE -threads 4 -phred33 \ ##指定内存、线程以及测序类型
raw_R1.fq.gz raw_R2.fq.gz \
clean_R1.fq.gz clean_unpaired_R1.fq.gz clean_R2.fq.gz clean_unpaired_R2.fq.gz \
ILLUMINACLIP:trim_adapter.fa:2:30:10 \ ##切除含接头污染的序列，允许的最大mismatch为2，palindrome模式下匹配碱基数为30，simple模式下的匹配碱基数为10；
LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36 \ ## 切除Reads两端碱基，参数：LEADING:3 TRAILING:3，截掉Reads首端和末端质量值小于3或为N的碱基；舍弃Trim后长度小于36nt的Reads ##采用滑窗法切除Reads中低质量的碱基，参数：SLIDINGWINDOW:4:15，4bp窗口内碱基质量均值小于15则切除；
2> trim_report.txt

过滤完成，得到clean数据后，就可以进行数据的比对、质控，以及各种可视化展示和peak calling分析了。后续分析内容，我们下期继续进行分享，感兴趣的小伙伴，赶快关注我们吧~

参考文献：

1. Mieczkowski, J. et al. MNase titration reveals differences between nucleosome occupancy and chromatin accessibility. Nat. Commun. 7, 1 1485 (2016).
2. Crawford, G. E. et al. DNase-chip: a high- resolution method to identify DNase I hypersensitive sites using tiled microarrays. Nat. Methods 3, 503–509 (2006).
3. Song L , Zhang Z , Grasfeder L L , et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity[J]. Genome Research, 2011, 21(10):1757-1767.
4. Krebs, A. R. et al. Genome- wide single- molecule footprinting reveals high RNA polymerase II turnover at paused promoters. Mol. Cell 67, 41 1–422
5. Schmidt D , Wilson M D , Spyrou C , et al. ChIP-seq: Using high-throughput sequencing to discover protein–DNA interactions[J]. Methods, 2009, 48(3):0-248.
6. Buenrostro, J. D., Giresi, P . G., Zaba, L. C., Chang, H. Y . & Greenleaf, W. J. T ransposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA- binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods 10, 1213–1218 (2013).
7. Klemm S L, Shipony Z, Greenleaf W J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome[J]. Nature Reviews Genetics, 2019: 1.
8. https://informatics.fas.harvard.edu/atac-seq-guidelines.html(2017).