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      • 实例解读| lncRNA在胃癌中的作用 | 高分SCI发表(第十二期)

      实例解读| lncRNA在胃癌中的作用 | 高分SCI发表(第十二期)

      • 发布者 weinfoauthor
      • 分类 未分类
      • 日期 2019年10月16日
      • 评论 0评论

      长链非编码RNA (lncRNA) lncRNAlncRNAlncRNA

       

      简单介绍:

      论文题目:LncRNA GClnc1 Promotes Gastric Carcinogenesis and May Act as a Modular Scaffold of WDR5 and KAT2A Complexes to Specify the Histone Modification Pattern

      发表杂志:CANCER DISCOV; 6(7): 784-801.

      发表年份:2016年

      影响因子:20.011

      发表单位:上海交通大学

       

      文章基本思路:

      A 生物信息学分析:找到8个显著的lncRNA;

      B 临床结果与生物信息学结果的结合:确定了1个Candidate lncRNA;

      C 分子实验:证实了GClnc1的生物学机制;

       

      GClnc1 (BC041951) 与胃癌的关系

      为了研究lncRNA与胃癌的关系,作者首先使用LncRNA芯片对10对胃癌/癌旁组织样本进行检测,发现了8个lncRNA在胃癌样本中显著升高。对分析的结果的可靠性进行验证,作者使用Real-time PCR在新的样本集中对这8个候选lncRNA的表达水平进行了检测(165对胃癌/癌旁),其中4个lncRNA得到验证。最后,作者用Kaplan–Meier 生存分析的方法,只发现GClnc1这个lncRNA的高表达与胃癌患者的不良预后显著相关。

      img

      在对正常胃组织、胃黏膜肠上皮化生组织、胃不典型增生组织和胃癌组织的研究中发现,GClnc1表达量逐渐升高;并且,其高表达和血管入侵、肿瘤大小等生理指标都是显著正相关的。这些结果表明,GClnc1高表达可能在胃癌初期就发挥了重要的作用,并且伴随胃癌共同发展,促进了癌症的恶化。

      img

      对之前的结果在新的胃癌样本中进行验证(103对胃癌/癌旁),原位杂交的结果表明在胃癌组织中GClnc1的表达明显高于正常组织。

      img

      所以,GClnc1作为一个风险lncRNA,不仅增加了人们的患胃癌的风险,增加了胃癌的病情,降低了患者的预后,但是,它的机制到底是什么样子的呢?

      GClnc1的序列分析

      首先要确定GClnc1是否是一个新发现的lncRNA,使用RACE PCR技术得到GClnc1的完整序列;其次,利用ChIP等技术确定了GClnc1的5’端RNA聚合酶II的结合位点和转录起始位点等序列的基本特征;结合生物信息学分析的方法对序列特点进行分析,发现该序列不具备编码蛋白质的能力。因此,GClnc1是一个新发现的lncRNA。

       

      GClnc1如何促癌

      Ok,根据上面的分析已经从很多方面证明了GClnc1的促癌左右,但是作者并不满足于此,继续深入挖掘GClnc1到底是如何促癌的。首先,通过对比knockdown GClnc1表达的胃癌细胞与未作处理的胃癌细胞进行差异分析,2,050基因显著下调,1,894基因上调显著(看来GClnc1的功能很强大!)。对差异基因进行通路分析,这些基因主要富集在细胞增殖,转移,胃癌的化学药物抗性和胃癌的信号等通路上。

      img

      做完Pathway分析后,作者竟然还凶残的想要用实验来证明他的分析结果,观察是否有由于这4个通路变化导致表型的改变。耸人听闻的是,他还做到了。首先,在两个胃癌细胞系中做RNA沉默,GClnc1低表达的胃癌细胞的细胞增殖、入侵能力明显降低;其次,在小鼠试验中,肿瘤增长与大小和GClnc1表达正相关;然后,药物处理使GClnc1失敏,结果与之前的生信结果保持一致;最后,在细胞入侵和细胞转移的实验中,GClnc1低表达的胃癌细胞入侵和转移的能力都受到了抑制。这些结果都说明了GClnc1这个家伙在促癌方面有举足轻重的作用。

      img

       

      GClnc1与WDR5/KAT2A复合体结合调节基因表达

      上面一大波的实验,小编已经佩服的五体投地了。但是,你以到此为止了么?只能说我们too young to simple,作者的想法就是走自己的路,让我们无路可走。。。

      有很多lncRNA会与转录因子、组蛋白调节因子等细胞因子相互作用,调节靶基因的表达,从而影响表型的变化。为此,作者又用一系列科学严谨(眼花缭乱)的实验,成功从195个候选的转录因子中找到了WDR5和KAT2A。甚至,他们还证明了是GClnc1的5’端与WDR5和KAT2A在胃癌细胞中特异性结合。

      img

      找到了互做的目标因子,下一步就要证明当GClnc1结合WDR5/KAT2A复合体后,如何和基因组结合调控靶基因的表达。根据ChIP-seq技术的结果发现,GClnc1被沉默后,147个基因被WDR5/KAT2A复合体共同结合调控表达。当GClnc1沉默时,80%候选基因的启动子区域与WDR5/KAT2A复合体结合下降。综上所述,GClnc1被knockdown后,调节了WDR5/KAT2A复合体与靶基因的结合效率。表达数据也再次证明了实验结果,在BGC823细胞系中沉默掉GClnc1,大部分WDR5/KAT2A复合体参与调控的基因表达也显著下降。说明GClnc1可能作为一个Scaffold与WDR5/KAT2A复合体相互作用,因此而具备了调控组蛋白修饰、基因表达等生命活动中。

       

       

       

      GClnc1调节SOD2的机制

      根据上文中的分析结果,作者找到了很多可能被GClnc1调控的基因,所以,作者就从中挑选了一个基因,来进一步展示GClnc1的潜在生物机理。SOD2作为一个WDR5/KAT2A复合体的靶基因,不仅与GClnc1的表达显著正相关,在之前的文章中也证明SOD2与胃癌的恶化显著相关 [1, 2]。作者的研究步骤如下:第一,由于SOD2 和GClnc1基因序列有一定的重叠区域,所以作者首先确定的就是它们不是同一个转录本;第二,Real-time PCR和Western blot的结果都表明,GClnc1高表达会上调SOD2的表达,反之亦然;第三,萤光素酶实验则表明knockdown了GClnc1会影响SOD2启动子的转录水平;第四,反过来knockdown或者用CRISPR/Cas9技术knock out掉SOD2,胃癌细胞的增殖、入侵等表型也显著下降。在之后的实验中,作者证明了GClnc1有可能作为一个脚手架结构的lncRNA与WDR5/KAT2A复合体共同结合在SOD2的启动子区,反式激活该基因的转录。

       

       

      感谢大家浪费自己宝贵的时间看小编写的推文,但是,小编发自肺腑的推荐这篇文章,不论是分析组或是实验组的小伙伴们,这篇文章都可以帮助大家学到很多东西。如果有时间,还是希望大家可以自己去仔细研读哦。

       

       

      img

      参考文献:

       

       

      \1. Janssen, A.M., et al., Superoxide dismutases in gastric and esophageal cancer and the prognostic impact in gastric cancer. Clin Cancer Res, 2000. 6(8): p. 3183-92.

      \2. Chen, P.M., et al., Activation of NF-kappaB by SOD2 promotes the aggressiveness of lung adenocarcinoma by modulating NKX2-1-mediated IKKbeta expression. Carcinogenesis, 2013. 34(11): p. 2655-63.

      \3. Sun, T.T., et al., LncRNA GClnc1 Promotes Gastric Carcinogenesis and May Act as a Modular Scaffold of WDR5 and KAT2A Complexes to Specify the Histone Modification Pattern. Cancer Discov, 2016. 6(7): p. 784-801.

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