Rsamtools 批量处理 bam 文件

测试开头

没关注？伸出手指点这里—

1引言

之前推文对于 Ribo-seq 比对的 bam 文件都是示例单个样本操作的,往往情况下我们会有多个样本, 那么如何批量读入 bam 文件,批量绘图呢?

这里分享一些批量读取 bam 文件和批量绘图的方法,核心是学会 lapply 函数就行了。

2分析

这里有两个 bam 文件作为示例:

library(Rsamtools)
library(tidyverse)
library(ggplot2)
library(stringr)
library(ggsci)
library(patchwork)

# bam file
bam <- c('ribo-EB.bam','ribo-ESC.bam')

# sample name
name <-  c('ribo-EB','ribo-ESC')

# read bam files
bamfile <- lapply(bam,BamFile)
bamfile

# [[1]]
# class: BamFile
# path: ribo-EB.bam
# index: NA
# isOpen: FALSE
# yieldSize: NA
# obeyQname: FALSE
# asMates: FALSE
# qnamePrefixEnd: NA
# qnameSuffixStart: NA
#
# [[2]]
# class: BamFile
# path: ribo-ESC.bam
# index: NA
# isOpen: FALSE
# yieldSize: NA
# obeyQname: FALSE
# asMates: FALSE
# qnamePrefixEnd: NA
# qnameSuffixStart: NA

# scan bamfiles/take some time dependent on your file size
aln <- lapply(bamfile,scanBam)

# check
length(aln)
# [1] 2

可以看到读入的两个文件以 list 格式储存到 aln 对象里了。

read length

绘制两个样本的 read 长度分布,数据处理:

# read length
lapply(1:length(aln),function(x){
  len <- aln[[x]][[1]]$qwidth %>% table %>% data.frame()
  colnames(len)[1] <- 'pos'
  # assign sample name
  len$type <- name[x]
  return(len)
}) %>% Reduce('rbind',.) %>% data.frame() -> plen

绘图:

# plot
plength <- ggplot(plen,aes(x = pos,y = Freq)) +
  geom_col(fill = 'grey40') +
  theme_bw(base_size = 16) +
  scale_y_continuous(labels = scales::label_number(),) +
  theme(axis.ticks.length = unit(0.25,'cm'),
        aspect.ratio = 0.5,
        axis.title = element_text(size = 18)) +
  xlab('Footprint length (nt)') + ylab('Reads (Fraction)') +
  facet_wrap(~type,scales = 'free_y',ncol = 2)

plength

frame distribution

数据分析:

# aggsign frame

lapply(1:length(aln), function(x){
  # 统计 frame 比例
  df <- data.frame(aln[[x]][[1]]$rname,aln[[x]][[1]]$pos,aln[[x]][[1]]$qwidth) %>% na.omit()
  colnames(df) <- c('rname','pos','qwidth')
  # 提取start codon位置
  df$st_pos = sapply(str_split(as.character(df$rname),'_'),'[',4) %>% as.numeric()

  # 提取stop codon位置
  df$sp_pos = sapply(str_split(as.character(df$rname),'_'),'[',5) %>% as.numeric()
  df$st_pos = df$st_pos + 1
  # 计算total reads frame类型
  df$yushu <- abs(df$pos-df$st_pos) %% 3

  # assign frame type
  df$frame <- case_when(
    df$yushu == 0 ~ "Frame 0",
    df$yushu == 1 ~ "Frame 1",
    df$yushu == 2 ~ "Frame 2")

  df$type <- name[x]
  return(df)
}) %>% Reduce('rbind',.) %>% data.frame() -> all_df

# check
head(all_df,3)
#                                                      rname pos qwidth st_pos sp_pos yushu
# 1 Chmp1a_ENSMUSG00000000743_ENSMUST00000000759_88_676_2140   8     29     89    676     0
# 2 Chmp1a_ENSMUSG00000000743_ENSMUST00000000759_88_676_2140  14     30     89    676     0
# 3 Chmp1a_ENSMUSG00000000743_ENSMUST00000000759_88_676_2140  29     30     89    676     0
#     frame    type
# 1 Frame 0 ribo-EB
# 2 Frame 0 ribo-EB
# 3 Frame 0 ribo-EB

统计:

# 按read长度统计frame数量
len.frame <- all_df %>% filter(qwidth %in% c(25:35))

# 统计
len.frame.sum <- len.frame %>% group_by(type,qwidth,frame) %>%
  summarise(count = n())
len.frame.sum$per <- len.frame.sum$count/sum(len.frame.sum$count)

绘图:

# bar plot
plengthframe <- ggplot(len.frame.sum,
                        aes(x = factor(qwidth),y = per,fill = factor(frame))) +
  geom_col(show.legend = T,width = 0.75,position = position_dodge2()) +
  theme_bw(base_size = 16) +
  scale_y_continuous(labels = scales::label_percent(),n.breaks = 6) +
  # scale_fill_brewer(palette = 'Set1',name = '',label = c('Frame 0','Frame 1','Frame 2')) +
  scale_fill_npg(name = '',label = c('Frame 0','Frame 1','Frame 2')) +
  theme(axis.ticks.length = unit(0.25,'cm'),
        aspect.ratio = 0.6,
        panel.grid = element_blank(),
        axis.title = element_text(size = 18)) +
  xlab('Footprint length (nt)') + ylab('Numbers of Reads') +
  facet_wrap(~type,scales = 'free',ncol = 4)

plengthframe

read density on transcript

# 提取transcript length位置
all_df$len = sapply(str_split(as.character(all_df$rname),'_'),'[',6) %>% as.numeric()

# assign region
all_df$rel <- case_when(
  all_df$pos < all_df$st_pos ~ abs(all_df$pos/(all_df$st_pos-1)),
  all_df$pos >= all_df$st_pos & all_df$pos < all_df$sp_pos + 2 ~ (all_df$pos - all_df$st_pos)/(all_df$sp_pos +2 - all_df$st_pos)+1,
  all_df$pos >= all_df$sp_pos + 2 ~ (all_df$pos - all_df$sp_pos -2)/(all_df$len - all_df$sp_pos - 2)+2
)

# to data frame
rel2cds <- data.frame(rel = all_df$rel,type = all_df$type)

# plot
ggplot(rel2cds,aes(x = rel)) +
  geom_density(bw = 0.00001,size = 1,color = '#00AFC1') +
  scale_x_continuous(breaks = c(0.5,1.5,2.5),labels = c("5'UTR","CDS","3'UTR")) +
  theme_bw(base_size = 16) +
  theme(aspect.ratio = 0.5) +
  geom_vline(xintercept = c(1,2),lty = 'dashed',size = 1) +
  facet_wrap(~type,scales = 'free',ncol = 2) +
  xlab('Ribo density on transcript')