Fastqc结果的超详细解读

. 1.Basic Statisics

介绍数据的基本信息，需要关注的有三行：

（1）Encoding：质量体系

现在的illumina测序都采用Pred33，显示Sanger/illumina 1.8+

比较老的数据则只显示illumina 1.8-，使用时一般需要转换

（2）Total Sequence：reads总数

（3）Sequence length：序列长度

三代测序的数据序列长短不一

. 2.Per base sequence quality

反应单个碱基质量的象限图

横坐标：碱基位置

纵坐标：碱基质量

每个碱基的上下两条横线：表示质量最大值和最小值

中间红线：中位数

黄色矩形的上下边：上四分位/下四分位

下四分位纵坐标读数为x，则表示有75%的碱基质量值大于x，25%的碱基质量值小于x。

因此，黄色矩形越长（下四分位对应的纵坐标值就越低），碱基质量也就越差。

合格的碱基质量图，黄色矩形短，最小值也都在30以上。

不合格的碱基质量图，则是一片黄色，最小值落到了非绿色部分。

三代测序因序列长度很大，质量图会把部分横坐标合并显示。二代测序则没有必要合并。在对二代测序数据进行质控时，可以设置-nogroup参数，使其不分组合并显示。

. 3.per tile sequence quality

豆豆介绍过测序板的组成：flowcell -lane -tile。

有的tile 的数据测序质量差，需要过滤掉。

横坐标：碱基位置

纵坐标：tile编号

颜色越暖，质量越差。显示红色的tile测序结果很差。

好的数据应该是全部蓝色。

. 4.per sequence qulity scores

所有reads的平均质量值分布

横坐标：质量值（平均质量值）

纵坐标：这个质量值的reads数

那么峰值就代表着某个质量值的reads数很多

好的质量图峰值靠后，在30以上。差的质量图在靠前或中间位置有小的峰值。

. 5.AT是否相等

测序过程中，被随机打断的DNA片段需要添加接头，然后连接到flowcell上。这个过程成功率并非100%，因此建库测序的过程相当于大样本随机抽样。

DNA碱基互补，在数量上A=T，C=G。经过建库测序后，只要测序量足够大，测出的结果也应是约等于。

横坐标：reads上的碱基位置

纵坐标：四种碱基所占百分比

（1）曲线两两重合：数据合格

（2）每条曲线都是波浪形，无明显规律：数据量不够大

（3）头部几个位置上，四个碱基的百分比有一个100%，三个0%：

说明reads头部为特定碱基，可能是酶切导致，多见于RAD测序中。后续位置的碱基曲线基本重合，这样的数据也是合格的。

（4）头部13个碱基AT不等，后续曲线基本重合。

RNA测序建库需要将其反转录为cDNA，头部13个碱基无规律是由于RNA建库使用随机引物造成的，正常。

（5）无明显规律

RNA链特异性建库：将反义链消化掉，只保留义链。（反义链与RNA互补，义链与RNA方向一致，序列除u碱基外相同。

不存在互补，所以碱基百分比无明显关系。

. 6.Sequence Duplication levels

Sequence Duplication是指reads完全重复，造成浪费。

产生原因：

（1）基因组中的重复序列

（2）不同细胞中的多套序列

（3）pcr扩增（主要原因）

解释：TruSeq建库测序流程

（1）随机打断，选择特定的长度

如双端测序150碱基，可选长度为300-800

如果序列长度为200，两端各测150，则中间50个碱基被重复测序，叫做overlap，也是一种资源浪费。

如果长度为800，中间有500是测不到的。但由于是随机打断，这段未被测到的序列会在其他片段中被测到。

（2）末端修复，添加接头

（3）pcr

（4）上机测序

正常的duplication比例是4%左右，过高的原因是：

（1）过多的pcr扩增。

正常扩增6轮，形成2^6^个拷贝。如果DNA含量太低，则需要增加扩增循环数，形成千百个拷贝。

大片段测序：基因组拼接需要构建mate paird文库，需要将dna进行环化，成功率低，因此需要更多拷贝。

（2）目标片段长度差异太大

同样的时间内，短序列片段得到的pcr扩增数量更大。

（3）RNA-Seq

duplication高，无法确定是来源于基因的高表达还是pcr扩增，因此不做过滤。

看家基因：在所有细胞中均要稳定表达的一类基因，其产物对维持细胞基本生命活动所必需的。

横坐标：reads出现的次数

纵坐标：横坐标对应次数的reads所占百分比

红色线：按照reads种类来计算的（去除duplication）

蓝色线：按照reads总数来计算的（duplication计算在内）

实际分析中，为了降低内存占用和时间：

仅分析前10万条序列在整个文件中的重复次数

>75bp的reads仅截取前50bp进行统计分析

>10次的合并显示

. 7.序列污染

污染的来源：adapter（接头）primer（引物）/细菌污染

（1）per sequence GC content

好的结果基本应该呈现正态分布

不同物种的GC含量有所不同，动植物的GC含量在35-50%之间，细菌的GC含量变化较大

曲线不规则，在此范围以外出现异常的极高峰的是污染，但无法判断污染来源。

（2）duplication level曲线

可判断异常reads的数量和种类。若红色曲线（种类）接近0，蓝色曲线（数量）大，则说明是少数几种reads出现了非常多次的扩增。

（3）overrepresented sequences

列出出现次数很多的可疑序列及其占比和来源，看前几种序列的百分比加和是否与duplication level蓝色曲线中显示的异常reads数量占比吻合，同时查看其来源。

（4）adapter content

查看是否存在adapter 污染

（5）k-mer content

关于什么是kmer，找到了一个优质解答：

将一条reads连续切割，挨个碱基滑动，得到的一组序列长度为k的核苷酸序列。

例：read序列为：ACT GGT GCT AAT GAC GAT。采用7-mer分析

结果为：

ACT GGT G

CT GGT GC

T GGT GCT

GGT GCT A

……

看懂了吗，第一行以reads第一个碱基为起点，第二行以reads第二个碱基为起点，以此类推。每行的长度都是7。

kmer content是看这7个碱基的不同排列组合方式出现的次数。出现次数最多的碱基，通常可以在overrepresented sequences图中找到，并查看它的来源。

序列污染的处理方法：

adapter和primer带来的污染，直接在数据过滤环节将污染序列去除掉。

细菌带来的污染，需要和细菌数据库进行比对，看看比对到的序列存在的物种，结合实验中可能存在的污染情况综合考虑，确定后将其去除。

初学生信，很荣幸带你迈出第一步。

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