今天是生信星球陪你的第17天

   你想找辆共享单车，发现满街都是别家车，没有一辆你能骑。

   你想学点生信，搜了“初学者教程”，满眼尽是高大上，没有一句能看懂。

   终于你跨越茫茫宇宙，来到生信星球，发现了初学者的新大陆！

1. 人物背景

     传说有一个大BOSS叫“冲冲”，型号和地位与紫薯侠差不多, 洋名叫”flowcell”（flow~flow～冲一冲）。

      他有八个手下是平行关系，叫“莱茵”，从1-8编号。名字是不是很优美？我起的！(其实人家叫lane啦) 。
      每个手下负责一群复制椅子，人坐在复制椅上边就能被复制很多很多次，就像StarWar里被复制的风暴兵。

2. 故事起因

      隶属于基因组，代号“DNA”的众多高级军官在一起开一个官方论坛，不幸遭到人类有目的的超声波攻击(测序过程就是用超声波将基因组打断)，每一个军官都被拆散，他们心想“只有我们这几个军官也抵挡不住啊，那么就扩增吧，用我们的身体作为本体”。
     想要建设强军(就是构建文库的过程), 首先先调整队伍，缺胳膊少腿的先进行末端修复——在脚下添加钢甲–> 3’ A，(构建文库第一步)，又限定了身高范围 (这就是构建文库第二步——选择特定长度片段), 又在头顶和脚底连接上传输线—“接头”(构建文库第三步)
(头顶5’要连接到复制椅，没有头顶的的天线你就不是天线宝宝，复制椅无法和你交流；                 

脚下3’作用除了连接，还有就是帮助划分成分，叫Index，给你加个标签，别下了机器不认识是哪个军官)。

【一般建库完成若是用于RNA-seq大概有200bp，DNA-seq大概500bp(重测序)】
      只有两条传输线都连到复制椅上才准备就绪，找出了他们窃取的人类埋藏多年的复制秘籍：PCR。

3. 意外发生

     正常情况下，一般是一个长官复制得到自己的一个风暴兵团就搞定了。

   （每个长官都会被复制N次，得到属于他的2**N个风暴兵复制体）

——————但是——————

意外一：复制出来的风暴兵都是相同的【其实产生同一个DNA片段大量拷贝(暴风兵)的目的就是提高接下来每一个碱基位点识别的准确性，每一个拷贝就是一个重复】，按说到这里就应该复制结束了，风暴兵也已经领了盒饭–>即测序完成（因为illumina边合成边测序），但是有的风暴兵淘气地坐上了复制椅，又复制了一批完全相同的，可以说是很浪费资源了。
(这个叫做PCR duplicates，重复来源是PCR过程)

意外二：一个长官的头上传输线连到了一个复制椅，脚底的不小心被人踢了一脚，本应该连在自己椅子上的，结果连到了旁边的椅子上，这样就产生了两个同样的长官，然后各自又复制，但结果都是一样的，产生了两批一样的风暴兵
(这个叫做Cluster duplicates, cluster就是这里的长官)

意外三：负责辨别风暴兵的工作人员要用眼睛观察，但他看时间长了老眼昏花，有点散光，把刚复制的军团中的每一个风暴兵看成了两个，所以这一批风暴兵军团又被“误诊”成了两批。( 唉! 保护视力很重要啊 )
(这个叫Optical duplicates 光学重复)

意外四：（比较特殊！）某个长官的老婆不巧出现了（他们的关系很简单：男<->女 = 反向互补）老婆来了一看很好奇。她也要同时去复制一批，他们俩一起坐在复制椅上，得到的军团也都是一批男的一批女的。像这种特殊的军团组合，就会被外界媒体评为“反向互补复制体”
(这个叫做：Sister duplicates，真的和sister没啥关系)

4. 结局

结局：每个故事都有一个结局，今天的结局就是：
后期过滤软件一个响指～多余的duplicates灰飞烟灭，活着的兵团排兵布阵，继续进发!

好啦，今天故事讲完啦! 

总结一下：

意外毕竟是意外，一般测序数据的duplicate比例都在10%以下。

举个🌰，用fastqc检测后duplicate比较好的情况是这样

很差的是这样：

      若要去除序列中的重复序列，可以使用SOAPNuke filter -d参数。

      一般对原始数据进行处理，这个重复序列并不是很重要，影响较大的应该当属：接头序列和低质量碱基或低质量read。

• 如果二者都要去除，可以选择Trimmomatic;

• 如果只需要过滤低质量碱基或read，可以用Trimmomatic或者sickle;

• 如果不想让read被过滤掉，并且是Phred 33 的质量体系，可以用seqtk.
  

PCR本身还会带来一些其他的问题，比如扩增过程自带了一定的偏向性，这会损失一定的测序随机性。只要DNA起始量足够，那么我们就应该尽量采用PCR- Free的方式来建库。

       初学生信，很荣幸带你迈出第一步。

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