测序数据过滤

今天是生信星球陪你的第74天

   你想找辆共享单车，发现满街都是别家车，没有一辆你能骑。

   你想学点生信，搜了“初学者教程”，满眼尽是高大上，没有一句能看懂。

   终于你跨越茫茫宇宙，来到生信星球，发现了初学者的新大陆！

1.操作顺序

质控—过滤—质控

质控发现了数据有哪些问题，就要把问题数据过滤掉，好的数据还是可以用滴。

2.数据可能存在的问题

（1）低质量-remove/trim

（2）污染–包括adapter/primer污染，细菌污染

（3）duplication

（4）序列太短

3.过滤工具

（1）SOAPnuke

华大开发，内部使用。 设置好参数后，所有的过滤步骤可以一步完成，生成简单的统计报告。

特点：

• 功能强大

• 安装稍复杂

• 有统计结果

• 低质量 remove，不能trim
  （现在的测序量大，数据够用，这种方法可行。）

• 需要手动输入adapter序列参数

• 快

（2）Trimmomatic（就用它）

• java 不需要安装

• 低质量trim，保留更多数据

• 自带adapter库

• 不能处理duplication

（3）FASTX-Tookit

功能齐全，可以质控。使用麻烦。

4.使用trimmomatic过滤数据

java -jar trimmomatic-0.35.jar 
PE
input_forward.fq.gz input_reverse.fq.gz
output_forward_paired.fq.gz output_forward_unpaired.fq.gz
output_reverse_paired.fq.gz output_reverse_unpaired.fq.gz  
ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10
LEADING:3
TRAILING:3
SLIDINGWINDOW:4:15
MINLENTH:36

运行：nohup  sh x.sh &

可修改处：

• 第一/五行：不在安装目录下处理数据时应改为安装软件的绝对路径

• 第二行：PE是双端测序，如果处理单端测序应改为SE

• 二/三行：输入/输出文件名，可改为自己的文件名

(1)ILLUMINACLIP:

作用：去掉adapter和primer等

命令：ILLUMINACLIP：TruSeq3-PE.fa:2:30:10

指定使用的adapter，存放在adapters目录下，有多个

如何选择adapter库：

方法1：Truseq2 用于早期的GAII machines，TruSeq3用于 HisSeq and MiSeq machines。

方法2：根据FASTqc结果中的overrepresented Sequencece图表最后一列选择。

— Illumina Single End或Illumina Paired End，使用 TruSeq2

— Truseq Universal Adapter TruSeq Adapter,Index ……，使用TruSeq3

（2）SLIDINGWINDOW:4:15

如果连续4个碱基平均质量值低于15，则把这四个碱基去掉，reads变成两条。

另一种策略：maxinfo

reads长度和质量的平衡

做基因组拼接：需要更长的reads

做变异检测：需要更高的质量值，对reads长度要求不高。

eg:MAXINFO：60:0.2

argv1:期望的reads长度

argv2:取值范围0-1之间，代表reads的长度和碱基质量的平衡。

值越小说明需要更长的reads，值越大说明需要更高的质量。

（3）MINLENTH:36

去除小于36bp长度的reads

(4)LEADING:3  TRAILING:3

fastqc结果显示有的序列头部几个碱基质量较差，这个参数的意思是将reads前段/后段质量值低于3的碱基去掉

CROP/HEADCROP：最多保留N个碱基长度，从末尾/头部剪掉多余的碱基。

CROP：100 仅保留前100碱基，从尾部去掉多余的碱基。

5.reads中为何会出现adapter污染

天蓝色：adapter库中的任意序列

深蓝色：我们的序列接头

绿色：有效序列

红色：无效序列

A：adapter完全比对到了一段reads

说明很长一段序列都存在污染，需要remove整条reads

B：adapter部分比对到了reads上

有20个碱基比对到，则污染

只3-4个碱基比对到，则无法判断是污染还是碰巧出现，需要用回文序列验证。

D：测到adapter的原因：序列过短

如果正反义链的3-段都又几个碱基能比对到adapter，说明是污染。

C：测序测到的直接是adapter，整段reads都是污染，叫做空载